Métodos para a realização Cruzes em<em> Setaria viridis</em>, Um novo sistema de modelo para as gramíneas
Summary
Nós desenvolvemos uma metodologia para a realização de cruzes em Setaria viridis (S. viridis). O método envolve a poda da panícula antes de um tratamento com água quente para matar pólen viável. Cruzes são executadas seguindo um regime de crescimento bem controlada e tipicamente resulta na recuperação de 1 a 7, a polinização cruzada de sementes / s por panícula.
Abstract
Setaria viridis é um sistema modelo emergente para C 4 gramíneas. Ela está intimamente relacionada com o estoque switchgrass alimentação bioenergia ea foxtail milho safra de grãos. Recentemente, o genoma 510 Mb de painço foxtail, S. Itálica, foi seqüenciado 1,2 e uma seqüência do genoma 25x cobertura da convivência em relação S. viridis está em andamento. S. viridis tem uma série de características que o tornam um potencial excelente sistema genético modelo incluindo um tempo de geração rápido, pequena estatura, os requisitos de crescimento simples, prolífica produção de sementes 3 e sistemas desenvolvidos para a transformação tanto transitória e estável 4. Contudo, a genética de S. viridis é em grande parte inexplorado, em parte, devido à falta de métodos detalhados para a realização de cruzamentos. Até o momento, nenhum protocolo padrão foi adotado, que permitirá a rápida produção de sementes a partir de cruzamentos controlados.
As pressões de protocolotura orientada aqui é otimizado para a realização de cruzamentos genéticos em S. viridis, A10.1 adesão. Nós empregamos um tratamento térmico simples, com água morna para castração após a poda da panícula de reter 20-30 florzinhas e rotulagem de flores para eliminar as sementes resultantes de flores recém-desenvolvidos após a emasculação. Depois de testar uma série de tratamentos térmicos a temperaturas permissivas, e variando o tempo de imersão, nós estabelecemos a uma temperatura óptima e intervalo de tempo de 48 ° C durante 3-6 min. Ao utilizar este método, um mínimo de 15 cruzamentos pode ser realizada por um único operador por dia e uma média de 3-5 descendência por cruzamento aberto panícula pode ser recuperado. Portanto, uma média de 45-75 progenitura cruzamento aberto pode ser produzido por uma pessoa num dia. Implementação Broad desta técnica vai facilitar o desenvolvimento de populações de linhas puras recombinantes de S. viridis X S. viridis ou S. viridis X S. italica, mapeando as mutações através de massa seanálise gregant e criar mutantes de ordem superior para a análise genética.
Introduction
S. viridis é uma NADP-ME subtipo C 4 grama intimamente relacionado com o estoque switchgrass alimentação bioenergia (NAD-ME subtipo), o foxtail milho safra de grãos, ea erva daninha agrícola guiné grama 5. O genoma 510 Mb de forma cultivada de Setaria, S. italica, foi recentemente seqüenciado 1,2 e uma seqüência do genoma 25x cobertura da relação de convivência, S. viridis, está em andamento (não publicado). S. viridis tem uma série de características que o tornam um potencial excelente sistema genético modelo incluindo um tempo de geração rápido, pequena estatura, os requisitos de crescimento simples e prolífica produção de sementes 3. Importante, métodos têm sido recentemente desenvolvidos para a transformação tanto transiente e estável de S. viridis, que oferecem a oportunidade para a criação de plantas transgênicas 4. No entanto, o principal entrave para o desenvolvimento de ferramentas genéticas para S. viridis é sua recalcitrance para cruzamento. Até à data, nenhum protocolo padrão foi publicado que irá permitir a rápida produção de sementes a partir de cruzamentos controlados.
Cruzamentos genéticos em S. italica são normalmente realizados por emasculação através da remoção das anteras das flores 6,7,8 ou através de tratamento térmico de flores de genitores femininos 9-11. Após esses tratamentos, anteras ou panículas de flores não tratados / pais masculinos são suavemente desgastada contra estigmas liberando pólen. Em emasculação, anteras são removidos usando uma pinça fina imediatamente após a florzinha abre eo anteras está começando a exsert, mas ainda não tem a vertente pólen 6-8. Entre os desafios deste último método é a dificuldade em realizar emasculação em um intervalo de tempo entre a abertura estreita e polinização da flor. A duração de abertura e de fecho de uma única flor irá variar dependendo da adesão e as condições ambientais e podem variar de 7 min <sup> 6-2,5 h 12 em S. italica. Uma vez que o derramamento de pólen ocorre como anteras exsert do flósculo, anteras precisam de ser removidos cuidadosamente e rapidamente, e por conseguinte, é difícil evitar a contaminação devido a auto-polinização. Além disso, como a polinização são realizadas imediatamente após a castração, o número de cruzamentos que podem ser exercidas por pessoa / dia é limitado.
Como um método alternativo, panículas maduras podem ser mergulhados em água quente para aquecer-matar desenvolvimento grãos de pólen 9,10,13,14, com a vantagem de realizar cruzamentos em um grande número de panículas. No entanto, a temperatura e duração do tratamento térmico varia largamente a partir de experiências diferentes (por exemplo, 47 ° C durante 10 minutos 14 e 42 ° C durante 20 min) 10. Além disso, há análises sistemáticas sobre a eficácia do emasculations mediada pelo calor foram publicados. Assim, um padrão e método simples para a realização de cruzamentos genéticos no S. viridis aceleraria muito o desenvolvimento de recursos genéticos e de estabelecimento de S. viridis como um sistema modelo no seio da comunidade de pesquisa.
Relata-se o desenvolvimento e otimização de um protocolo padrão para a realização de cruzamentos genéticos em S. viridis. As plantas são cultivadas em ambientes controlados para sincronizar o desenvolvimento da flor e aumentar a reprodutibilidade do processo. Cruzes são realizadas utilizando um S. transgénico A linha viridis como o progenitor masculino que contém o gene repórter GUS 4 para facilitar a identificação de cruzamentos genéticos controlados sucesso. O transgene GUS é accionado por um promotor de ubiquitina de arroz, que permite a contagem de sementes F1 imediatamente após a colheita e, assim, proporciona um ensaio qualitativo fácil de determinar a eficiência de emasculação e polinização. Nós empregamos um tratamento térmico simples, com água morna para emasculação acompanhada de rotulagem de flores que foram emasculated para eliminar as sementes resultantes de flores recém-desenvolvidos após a emasculação. Depois de testar uma série de tratamentos térmicos a temperaturas permissivas, e variando o tempo de imersão em água quente, nós estabelecemos a uma temperatura e tempo ideais durações de 48 ° C, 3-6 min. Um tratamento a frio madrugada foi encontrado para promover a antese síncrono em ambos os progenitores, de modo a facilitar a polinização cruzada. Também discutimos os principais passos no protocolo ea futura aplicação deste método a outras adesões Setaria.
Protocol
Representative Results
Discussion
Importância do tratamento antes do amanhecer
Para obter uma alta freqüência de progênie outcross é essencial ter antese altamente síncrona de pais masculinos e femininos. Inicialmente, pedalamos regimes de temperatura e luz (31 ° C/22 ° C, dia / noite) e usou o S. viridis A10.1 adesão para todas as polinizações. Sob essas condições, a maioria das flores abrem de manhã cedo antes que a temperatura sobe para 31 ° C, embora algumas flores abertas aleatoriamente entre 8h00-8: 00 PM. Estudos anteriores em S. italica indicam que hora do dia, local e época contribuir para a variação em antese 7,15,16. Siles et al. 6 observou que a antese foi associada com variações bruscas de temperatura e umidade, mas não com baixa temperatura e alta umidade, por si só, como concluiu em estudos anteriores 7,15. Por isso, nós empregamos um pré-tratamento do amanhecer frio de 15 ° C por 30 min (das 8:30 AM-9: 00 AM) para imitara condição de pré-amanhecer natural. Este tratamento frio da madrugada auxiliado na sincronização antese nos pais. Observou-se que, apesar de a câmara de ajuste para níveis de humidade relativa de 50%, a humidade relativa no interior da câmara aumentou para um nível superior a 70% quando a temperatura caiu de 22 ° C a 15 ° C e continuou a manter acima de 70% até a temperatura gradualmente subiu para 31 ° C depois de 9:30. Às 9:00 AM, emasculado genitores femininos e plantas do progenitor masculino são levados para o laboratório (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, RH: 21,79% ± 1,15%). As flores dos genitores masculinos começar a abrir em torno de 10:10, ea polinização pode ser realizada às 10:30 AM-11: 00 PM. Uma lista detalhada de todos os reagentes e equipamento é fornecido na Tabela 2.
Importância da preparação panícula para emasculação
Sob as condições da câmara neste estudo (Figura 1), o tempo de floração panícula primário variou de2-3 dias. Tipicamente, flores localizados no meio distal da inflorescência (Figura 2A) aberto primeira abertura e precede proximal e distal. O número ideal de flores a serem retidos na panícula é 20-30. O cuidado deve ser tomado durante a remoção de flores imaturas para que apenas flores bem desenvolvidos (a flor superior ou maiores na espigueta 17) são mantidas. A marcação com marca vermelha em ambos os lados das flores ajuda a distinguir eficientemente progenitura outcross putativo a partir de sementes de flores recentemente desenvolvidos após a castração. Além disso, é importante para deixar as cerdas sobre as panículas antes emasculação para proteger as florzinhas de danos extensos de calor, no entanto, como uma opção, que pode ser removido após a emasculação usando tesouras de mola, a fim de facilitar a polinização, especialmente quando a ligação de um panícula técnica é utilizada (Figuras 2C e 2D).
Optimizado uma temperaturaduração do tratamento d para tratamento de água quente
A base para a castração através de imersão de água quente é que o pólen é mais sensível ao calor do que a superfície estigmática. No entanto, a duração ea temperatura de tratamento térmico pode variar entre as espécies Setaria e adesões. Em geral, uma temperatura mais elevada, com um tempo de tratamento mais curto, ou uma temperatura mais baixa, com um tempo de tratamento mais prolongado terá o mesmo efeito sobre a emasculação. Tem sido relatado que um tratamento térmico de 42 ° C durante 20 min ou 10 a 47 ° C durante 10 min 14 rendeu S. italica pólen não viáveis, mas a eficácia destes tratamentos não foi determinada. Nós desenvolvemos o nosso protocolo seguindo a hipótese de que, sob uma temperatura otimizada e duração do tratamento, o pólen de todas as flores retida no progenitor feminino será inviável enquanto estigmas permanecerá receptivo. No entanto, depois de comparar e analisar os efeitos de diferentes temperaturas eperíodos de tratamento (Tabela 1), observou-se que a sensibilidade ao tratamento pelo calor varia entre as flores retidos em cada panícula, portanto, é difícil de eliminar completamente as sementes resultantes da auto-polinização. Conclui-se que a eficiência de produção de descendência cruzamento aberto é a maior quando os tratamentos são efectuados a 48 ° C durante 3-6 min em S. viridis A10.1 adesão.
Horário de pico de antese e polinização cruzada
Quando as flores atingem a maturidade e está prestes a abrir, as anteras são de cor branca amarelada na cor e pólen é derramado assim que as anteras das flores exsert 8. Anteras gradualmente virar marrom após pólen é derramado como as flores começam a fechar. Uma vez liberado, a viabilidade do pólen é desconhecida. Assim, é crítica a utilização do pólen de abertura ou as flores recém abertas com o progenitor masculino o mais rapidamente possível. Nas nossas condições de câmara (Figura 1), a maioria das flors dos genitores masculinos começam a abrir às 10:10 e as flores abertas lançar pólen às 10:30. Assim, a janela desejável para a realização de polinização é 10:30-11:00. Os estigmas permanecem fora das glumas após flores perto e pode ser receptivo ao pólen. Isto tem sido observado anteriormente e confirmada em S. italica que os estigmas são receptivos por cerca de 48 horas de abertura pós-flor por Siles et al. 6, por isso é importante saco panículas após tratamento térmico e após a realização de cruzamentos controlados. Como discutido acima, recomendamos polinizações desempenho em ambos os dia 2 e dia 3 pós-castração.
Métodos para a polinização
Comparou-se a eficiência de três técnicas de polinização. Se flores desabrochando não se limitando, a polinização panícula-to-panícula é a técnica mais eficiente e irá produzir um maior número de descendentes outcross. Se panículas florescendo estão limitando, uma maior frequência de outcross progénie será produzida quando o método de antera a-estigma é usado. Obtivemos progênie outcross de ambos os métodos de sucesso. O método "panículas ligação" tem sido utilizado na travessia S. italica 6, mas nós achamos que este método seja o método menos eficiente quanto a janela de tempo para o derramamento de pólen do progenitor masculino é curto. Além disso, há menos controlo sobre a polinização e as cerdas em S. panículas viridis também pode dificultar o movimento do pólen na superfície estigmática.
Colheita da semente, a secagem e armazenamento
Após a colheita, as sementes devem ser secos a 30-33 ° C durante 2 dias. Anthecium deve ser removido para a coloração de GUS, se necessário. As sementes devem ser armazenados em local fresco e seco (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, RH: 21,79% ± 1,15%) para o armazenamento de curto prazo (menos de dois anos) ou em uma câmara de semente (T: 4.0- 10 ° C ± 1,0 ° C, RH: 20% ± 1%) para o armazenamento a longo prazo.Más condições de armazenamento pode resultar em taxas de viabilidade baixos 8. Temos observado que a taxa de germinação de sementes de S. viridis A10.1 é de aproximadamente 5% quando semeadas quatro dias após a colheita, mas pode ser aumentado para 90-96% depois da armazenagem em laboratório (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, HR: 21,79% ± 1,15%) para 110 dias pós-colheita seguido por uma estratificação de três dias a -80 ° C para quebrar a dormência das sementes. Para a estratificação a -80 ° C, sementes secas pode ser colocado em um recipiente hermeticamente fechado (por exemplo, tubo de micro-centrifugação ou envelope moeda num saco de plástico selado) e mantida a -80 ° C durante 3 dias antes do plantio. Após 16 meses de armazenamento em laboratório (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, RH: 21,79% ± 1,15%), os percentuais de germinação de 90-95% ainda pode ser obtida. Além disso, para quebrar a dormência, as sementes podem ser secos a 30-33 ° C durante 2 dias após a colheita, e, em seguida, dada de três dias a estratificação a -80 ° C seguido pela remoção deanthecium antes de plantar. Após estes tratamentos, as taxas de germinação da semente até 33% pode ser conseguido.
Vantagens, limitações e possíveis modificações
Aqui nós fornecemos o primeiro protocolo padrão para a realização de cruzamentos em S. viridis A10.1 usando um tratamento térmico para emasculação. Em contraste com a castração física, este protocolo é menos invasivo e relativamente fácil de estabelecer em um laboratório. Geralmente, leva cerca de 15 minutos para cortar uma panícula e cerca de 15 panículas podem ser aparadas e cruzou / pessoa / dia. Assumindo uma média de 3-5 outcross progênie / panícula pode ser recuperado em condições otimizadas, um total de 45-75 progênie outcross pode ser produzido por uma pessoa em um único dia. Além disso, esta técnica pode ser aplicada a atravessa, em outras espécies de Setaria, embora optimizações adicionais serão susceptíveis. Se o espaço em câmara de crescimento é limitado, as plantas podem ser cultivadas em casa de vegetação ou câmaras de crescimento, sem um tesouro pré-amanhecertamento até a panícula emerge antes de serem transferidas para as condições da câmara otimizados.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Sankalpi Warnasooriya e Amy Humboldt para a leitura crítica e edição do manuscrito. Este trabalho foi financiado por doações do Departamento de Energia (DE-SC0008769) ea National Science Foundation (IOS-1127017).
Materials
| Name | Company | Cat. Number | |
| Scissors, spring | World Precision Instruments, Inc | 14126 | |
| Forceps, Dumostar Biology Polished | SPI Supplies | TD5BP-XD | |
| Surgical Scissors | F.S.T (Fine Science Tools) | 14005-12 | |
| Europack Clear Polypropylene Micro-Perforated Crusty Bread Bags 6″x28″ | http://www.pjpmarketplace.com | 361001 | |
| Flats | T.O. Plastics | 715401C | |
| metro mix 360 | Hommert International | 10-0356-1 | |
| Jack’s 15-16-17 | Hommert International | 07-5925-1 | |
| Kimwipes | VWR International | 34120 | |
| Sharpie Ultra Fine Point Permanent Markers, Red | Staples | 37002 | |
| Donegan DA-10 OptiVisor Headband Magnifier, 3.5x Magnification, 4″ Focal Length | Amazon | DA-10, B0015IP380 | |
| 12″24/7 Packaging Hand Impulse Sealer Heat Seal Machine Poly Sealing Free Element Grip | Amazon | N/A | |
| water bath | VWR scientific | Model: 1166 | |
| BDW walk in plant growth chamber | Conviron | BDW 40 |
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