שיטות לביצוע צלבים ב<em> Setaria viridis</em>, מערכת דגם חדש לעשבים
Summary
פיתחנו מתודולוגיה לביצוע צלבים בviridis Setaria (ס 'viridis). השיטה כוללת גיזום המכבד לפני טיפול במים חמים כדי להרוג את האבקה ובת קיימא. צלבים מבוצעים הבא משטר צמיחה מבוקרת היטב ובדרך כלל לגרום להתאוששות של 1 עד 7 האבקה צולבת זרע / s לכל מכבד.
Abstract
Setaria viridis הוא מערכת מודל מתעורר ל4 C עשבים. היא קשורה קשר הדוק ולקליפות מניית ההזנה ביואנרגיה ודוחן דוחן יבול תבואה. לאחרונה, הגנום 510 Mb של דוחן דוחן, ש ' italica, כבר רצף 1,2 ורצף הגנום 25x כיסוי של ס ביחס העשבים viridis הוא בהתקדמות. ס יש viridis מספר המאפיינים ההופכים אותו למערכת גנטית מודל פוטנציאל מצוין, כולל זמן דור מהיר, קומתו הקטנה, דרישות גידול פשוטות, ייצור זרע פורה 3 ומערכות שפותחו לשינוי הן זמני ויציב 4. עם זאת, הגנטיקה של ס viridis הוא נחקר במידה רבה, בחלקו, בשל חוסר שיטות מפורטות לביצוע צלבים. נכון להיום, אין פרוטוקול סטנדרטי אומצה שיאפשר ייצור מהיר של זרעים מצלבים מבוקרים.
נוכחות הפרוטוקולכאן ented מותאם לביצוע צלבים גנטיים בס viridis, A10.1 הצטרפות. יש לנו עובדי טיפול בחום פשוט עם מים חמים לסירוס לאחר הגיזום המכבד לשמור 20-30 פרחים וסימון של פרחים לחסל את הזרעים וכתוצאה מפרחים חדשים שפותחו לאחר סירוס. לאחר בדיקת סדרה של טיפולים חום בטמפרטורות מתירנית ומשתנה משך הטבילה, הקמנו טמפרטורה אופטימלית וטווח של 48 ° C זמן ל3-6 דקות. באמצעות שיטה זו, מינימום של 15 צלבים יכול להתבצע על ידי עובד אחד ליום וממוצע של 3-5 צאצאים outcross למכבד ניתן לשחזר. לכן, בממוצע 45-75 צאצאי outcross יכול להיות מיוצר על ידי אדם אחד ביום אחד. יישום רחב של טכניקה זו יאפשר הפיתוח של אוכלוסיות שורה טהורים רקומביננטי של ס ' viridis X ס viridis או ס viridis X ס italica, מיפוי מוטציות בתפזורת seניתוח gregant ויצירת מוטציות מסדר גבוהה יותר לניתוח גנטי.
Introduction
ס viridis הוא דשא NADP-ME C תת סוג 4 הקשור באופן הדוק ולקליפות הזנת יואנרגיה המניה (תת NAD-ME), דוחן דוחן יבול תבואה, והדשא גינאה עשב החקלאי 5. הגנום 510 Mb של צורה מעובדת של Setaria, ש ' italica, לאחרונה רצף 1,2 ורצף הגנום 25x כיסוי היחסי עשבים, ש ' viridis, הוא בהתקדמות (לא פורסם). ס יש viridis מספר המאפיינים ההופכים אותו למערכת גנטית מודל פוטנציאל מצוין, כולל זמן דור מהיר, קומתו הקטנה, דרישות גידול פשוט, וייצור זרע פורה 3. חשוב מכך, שיטות לאחרונה פותחו עבור שניהם שינוי החולף ויציב של ס viridis המספק ההזדמנות ליצירת צמחים מהונדסים 4. עם זאת, צוואר בקבוק עיקרי בפיתוח של כלים גנטיים לס viridis הוא recalcitrance לoutcrossing. נכון להיום, אין פרוטוקול סטנדרטי כבר פורסם שיאפשר ייצור מהיר של זרעים מצלבים מבוקרים.
צלבים גנטיים בס italica בדרך כלל מבוצע על ידי סירוס באמצעות הסרת מאבקים מפרחי 6,7,8 או באמצעות טיפול בחום של פרחים של הורים נשיים 9-11. בעקבות טיפולים, מאבקים או panicles מפרחים שאינם מטופלים אלה / הורי זכרים משופשפים בעדינות נגד סטיגמות שחרור אבקה. בסירוס, מאבקים יוסרו באמצעות מלקחיים קנס מייד לאחר פלוראט פותח והמאבק מתחיל exsert, אך טרם לשפוך אבקה 6-8. בין האתגרים של שיטה זו האחרונה הוא הקושי בביצוע סירוס במרווח זמן צר שבין הפתיחה וסככת אבקה של הפרח. משך הזמן של פתיחה וסגירה של פרח בודד ישתנה בהתאם להצטרפות ותנאי סביבה, ויכול לנוע בין 7 דקות <sup> 6-2.5 שעות 12 בס italica. מאז שפיכה של אבקה מתרחשת כמאבקי exsert מפלוראט, מאבקי צורך להסירו בזהירות ובמהירות, ולכן, קשה להימנע מזיהום עקב האבקה עצמית. בנוסף, כpollinations מבוצע מייד לאחר סירוס, מספר הצלבים שניתן לבצע לאדם / ליום מוגבל.
כשיטת חלופית, יכול להיות טבול panicles הבוגר במים חמים כדי לחמם-להרוג את פיתוח גרגרי אבקה 9,10,13,14 עם היתרון של ביצוע צלבים על מספר גדול של panicles. עם זאת, הטמפרטורה ומשך הזמן של טיפול בחום משתנים מאוד מניסויים שונים (למשל 47 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות 14 ו42 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות 10). יתר על כן, אין ניתוחים שיטתיים על היעילות של emasculations תיווך החום פורסמו. לכן, סטנדרטי ושיטה פשוטה לביצוע צלבים גנטיים בס viridis יאיץ פיתוח משאבים הגנטיים והקמתו של ס 'באופן משמעותי viridis כמערכת מודל בתוך קהילת המחקר.
אנו מדווחים על הפיתוח ואופטימיזציה של פרוטוקול סטנדרטי לביצוע צלבים גנטיים בס viridis. צמחים גדלים תחת סביבות מבוקרות כדי לסנכרן פיתוח פרח ולהגדיל את שחזור של ההליך. צלבים מבוצעים באמצעות ס מהונדס שורת viridis כהורה הזכר המכיל את גן כתב גאס 4 כדי להקל על זיהוי של צלבים גנטיים מבוקרים מוצלחים. Transgene גאס הוא מונע על ידי אמרגן היוביקוויטין אורז המאפשר את הניקוד של זרעי F1 מייד לאחר קציר ובכך מספק assay איכותי קל לקבוע את היעילות של סירוס והאבקה. יש לנו עובדי טיפול פשוט חום עם מים חמים לסירוס מלווה בתיוג של פרחים שהיו emasculaטד לחסל את הזרעים וכתוצאה מפרחים חדשים שפותחו לאחר סירוס. לאחר בדיקת סדרה של טיפולים חום בטמפרטורות מתירנית ומשתנה משך טבילה במים חמים, הקמנו משכי טמפרטורה וזמן אופטימליים של 48 ° C 3-6 דקות. טיפול קר לפני עלות השחר נמצא לקדם anthesis סינכרוני בשני ההורים על מנת להקל על האבקה צולבת. יש לנו גם דנו בשלבים העיקריים בפרוטוקול והיישום העתידי של שיטה זו להצטרפויות Setaria אחרות.
Protocol
Representative Results
Discussion
חשיבות של טיפול לפני עלות השחר
כדי להשיג תדירות גבוהה של צאצאי outcross זה חיוני שיהיה לי anthesis סינכרוני מאוד של הורי זכר ונקבה. בתחילה, אנו רכב על אופניו משטרי טמפרטורה והאור (31 ב° C/22 ° C, יום / לילה) ומשמשים ס A10.1 הצטרפות viridis לכל pollinations. בתנאים אלה, רוב הפרחים לפתוח מוקדם בבוקר לפני שהטמפרטורה עולה ליום 31 ° C, אם כי כמה פרחים פתוחים באופן אקראי בין 8:00 8: 12:00. מחקרים קודמים בס italica מצביע על הזמן של יום, מיקום והעונה תורמים לשונות בanthesis 7,15,16. סילס et al. 6 ציינו כי anthesis היה קשור עם שינויים מהירים בטמפרטורה ולחות, אבל לא עם טמפרטורה נמוכה ולחות גבוהה, כשלעצמה, כפי שסוכם במחקרים קודמים 7,15. לכן, אנו מועסקים טיפול קר לפני עלות השחר של 15 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות (מ 8:30 AM-9: 12:00) לחקותהמצב טרום זריחה הטבעית. טיפול קר לפני עלות השחר זה סייע בסנכרון anthesis בהורים. הבחנו כי למרות הגדרת התא לרמות לחות היחסית של 50%, הלחות היחסית בתוך החדר עלתה לרמה מעל 70% ככל שהטמפרטורה ירדה מ 22 ° C עד 15 מעלות צלזיוס והמשיכה להישאר מעל 70% עד לטמפרטורה עלה בהדרגה ל 31 ב° C לאחר 9:30 בבוקר. בשעת 9:00 בבוקר, מסורס הורים נשיים וצמחים של הורה זכר מובאים למעבדה (T: 24.06 ° C ± 0.13 מעלות צלזיוס, לחות יחסית: 21.79% ± 1.15%). פרחים של הורי גברים מתחילים פתיחה סביב 10:10, והאבקה יכולה להתבצע בשעה 10:30 AM-11: 12:00. רשימה מפורטת של כל חומרים כימיים והציוד מסופקת בטבלה 2.
חשיבותה של הכנה מכבדת לסירוס
בתנאי החדר במחקר זה (איור 1), משך הפריחה מכבדת העיקרית נע בין2-3 ימים. בדרך כלל, פרחים ממוקמים באמצע הדיסטלי של התפרחת (איור 2 א) proximally הראשון ופתיחה מקדימה פתוח וdistally. המספר האידיאלי של פרחים כדי להישמר על המכבד הוא 20-30. זהירות יש לנקוט בעת ההסרה של פרחים בשלה, כך שרק פרחים מפותחים (הפרח העליון או הגדול ביותר על spikelet 17) נשמרים. תיוג עם סמן אדום בשני הצדדים של הפרחים מסייע להבחין ביעילות צאצאי outcross משוערת מזרעים מפרחים חדשים שפותחו לאחר סירוס. בנוסף, חשוב להשאיר את הזיפים על panicles לפני הסירוס כדי להגן על הפרחים מפני נזקי חום רבים, עם זאת, כאופציה, הם יכולים להסיר לאחר סירוס באמצעות מספריים באביב על מנת להקל האבקה, במיוחד כאשר מכבד מחייבים טכניקה היא מועסק (2C דמויות ו2 ד).
טמפרטורה אופטימליתמשך טיפול ד לטיפול במים חמים
הבסיס לסירוס באמצעות טבילה במים חמה הוא שהאבקה היא רגישה יותר לחום מאשר משטח סטיגמות. עם זאת, משך הזמן והטמפרטורה של טיפולים חום עשויים להשתנות בין מינים והצטרפויות Setaria. באופן כללי, טמפרטורה גבוהה יותר עם זמן קצר יותר לטיפול או לטמפרטורה נמוכה יותר בזמן טיפול ארוך יותר תהיה לה ההשפעה על סירוס. זה כבר דווח כי טיפול בחום של 42 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות 10 או 47 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות 14 ס שניתנו אבקת italica שאינו ברת קיימא, אבל את היעילות של טיפולים אלה לא נקבע. פיתחנו הפרוטוקול שלנו בעקבות ההשערה כי תחת טמפרטורה ואת משך זמן אופטימליים של טיפול, אבקת פרחים של כל הפרחים שמרה על ההורה הנקבי יהיה שאינו בת קיימא תוך סטיגמות יישארו פתוחה. עם זאת, לאחר השוואה וניתוח ההשפעות של כמה טמפרטורות ותקופות טיפול (טבלה 1), מצאנו כי הרגישות לטיפול בחום משתנה בין הפרחים שמרו על כל מכבד, ובכך שקשה לחסל את הזרעים כתוצאה מהאבקה עצמית לחלוטין. אנו מסיקים כי היעילות בייצור צאצאי outcross היא הגדולה ביותר, כאשר טיפולים מבוצעים ב48 מעלות צלזיוס במשך 3-6 דקות בס A10.1 הצטרפות viridis.
זמן שיא של anthesis והפריה הדדית
כאשר הפרחים מגיעים לבגרות והם עומדים לפתוח, מאבקים הם לבנים בצבע צהבהב ואבקה נשפכה בהקדם מאבקי exsert מהפרחים 8. מאבקים הופכים בהדרגה חום לאחר האבקה נשפכה כפרחים מתחילים להיסגר. שוחרר פעם אחת, את הכדאיות של אבקה אינה ידועה. לכן, זה קריטי להשתמש באבקה מפתיחה או פרחים טריים פתחו בהורה הזכר בהקדם האפשרי. בתנאי החדר שלנו (איור 1), רוב floweRS של הורי גברים מתחיל לפתוח בשעת 10:10 בבוקר והפרחים נפתחו לשפוך אבקה בשעת 10:30 PM. לכן, החלון הרצוי לביצוע האבקה הוא 10:30-11:00. סטיגמות יישארו מחוץ לglumes אחרי פרחים קרובים ועשויות להיות פתוח לאבקה. זה כבר נצפה בעבר ואישר בס italica שסטיגמות הן פתוחים במשך כ 48 פתיחת הודעה פרח-HR על ידי סילס et al. 6, ולכן חשוב לpanicles התיק הבא טיפול בחום ולאחר ביצוע צלבים מבוקרים. כאמור לעיל, אנו ממליצים pollinations ביצועים בשני יום 2 ויום 3 שלאחר סירוס.
שיטות להאבקה
החוקרים השווינו את היעילות של שלוש טכניקות האבקה. אם פרחים פורחים לא מגבילים, האבקה מכבדת למכבדת היא הטכניקה היעילה ביותר ותניב מספר גדול יותר של צאצאי outcross. אם panicles הפורח מגביל, תדירות גבוהה יותר של oצאצאי utcross יופקו כאשר נעשה שימוש בשיטת מאבק ל- הסטיגמה. יש לנו להשיג צאצאי outcross משתי השיטות בהצלחה. שיטת "מחייב panicles" נעשתה שימוש בחציית ס italica 6 אבל מצאנו בשיטה זו כדי להיות השיטה היעילה לפחות כמו חלון הזמן לשפיכת אבקה של הורה הזכר הוא קצר. יתר על כן, יש פחות שליטה על האבקה והזיפים על ס panicles viridis עשוי גם לעכב את התנועה של אבקה על גבי משטח סטיגמות.
קצירת זרע, ייבוש ואחסון
לאחר קציר, צריכים להיות מיובשים זרעים ב30-33 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים. Anthecium יש להוציא עבור מכתים גאס, במידת צורך. זרעים צריכים להיות מאוחסנים במקום יבש, קריר (T: 24.06 ° C ± 0.13 מעלות צלזיוס, לחות יחסית: 21.79% ± 1.15%) עבור אחסון לטווח קצר (פחות משנתיים) או בתא זרע (T: 4.0 10 ° C ± 1.0 מעלות צלזיוס, לחות יחסית: 20% ± 1%) עבור אחסון לטווח ארוך.תנאי אחסון לקויים עלולים לגרום שיעורי כדאיות נמוכים 8. יש לנו ציינו כי שיעור הנביטה של ס A10.1 viridis הוא כ -5%, כאשר נזרע 4 ימים לאחר הקציר, אך ניתן להגדיל 90-96% לאחר האחסון במעבדה (T: 24.06 ° C ± 0.13 מעלות צלזיוס, לחות יחסית: 21.79% ± 1.15%) ל110 ימים לאחר קציר ואחריו ריבוד של שלושה ימים ב-80 ° C לשבור תרדמת זרעים. לריבוד ב -80 מעלות צלזיוס, ניתן להציב זרעים יבשים בכלי אטום (צינור למשל מיקרו צנטריפוגות או מעטפת מטבע בשקית פלסטיק אטומה) והמשיכו ב-80 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים לפני השתילה. לאחר 16 חודשים של אחסון במעבדה (T: 24.06 ° C ± 0.13 מעלות צלזיוס, לחות יחסית: 21.79% ± 1.15%), עדיין ניתן להשיג אחוזי נביטה של 90-95%. בנוסף, כדי לשבור את תרדמת, יכולים להיות מיובשים זרעים ב30-33 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים לאחר קציר, ולאחר מכן ניתנו ריבוד של שלושה ימים ב-80 מעלות צלזיוס ואחרי הסרתanthecium לפני השתילה. לאחר טיפולים אלה, שיעורי נביטת זרעים של עד 33% יכולים להיות מושגת.
יתרונות, מגבלות ושינויים אפשריים
כאן אנו מספקים פרוטוקול הסטנדרטי הראשון לביצוע צלבים בס viridis A10.1 באמצעות טיפול בחום לסירוס. בניגוד לסירוס פיזי, פרוטוקול זה הוא פחות פולשני וקל יחסית כדי להקים במעבדה. בדרך כלל זה לוקח בערך 15 דקות לקצץ מכבד אחד ויכול להיות מטופח -15 panicles וחצה / אדם / יום. בהנחה ממוצעת של 3-5 צאצאים / מכבד outcross ניתן לשחזר בתנאים מותאמים, סך של 45-75 צאצאי outcross יכול להיות מיוצר על ידי אדם אחד ביום אחד. יתר על כן, טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על חוצה במינים Setaria אחרים, אם כי אופטימיזציות נוספות תהיה סבירה. אם חלל חדר הצמיחה מוגבל, ניתן לגדל צמחים בבית ירוק או תאי גידול מבלי גיד לפני עלות השחרtment עד המכבד עולה לפני שהם עברו לתנאי בתא מותאם.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים Sankalpi Warnasooriya ואיימי הומבולדט לקריאה ולעריכה ביקורתיות של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ממשרד אנרגיה (DE-SC0008769) והקרן הלאומית למדע (IOS-1,127,017).
Materials
| Name | Company | Cat. Number | |
| Scissors, spring | World Precision Instruments, Inc | 14126 | |
| Forceps, Dumostar Biology Polished | SPI Supplies | TD5BP-XD | |
| Surgical Scissors | F.S.T (Fine Science Tools) | 14005-12 | |
| Europack Clear Polypropylene Micro-Perforated Crusty Bread Bags 6″x28″ | http://www.pjpmarketplace.com | 361001 | |
| Flats | T.O. Plastics | 715401C | |
| metro mix 360 | Hommert International | 10-0356-1 | |
| Jack’s 15-16-17 | Hommert International | 07-5925-1 | |
| Kimwipes | VWR International | 34120 | |
| Sharpie Ultra Fine Point Permanent Markers, Red | Staples | 37002 | |
| Donegan DA-10 OptiVisor Headband Magnifier, 3.5x Magnification, 4″ Focal Length | Amazon | DA-10, B0015IP380 | |
| 12″24/7 Packaging Hand Impulse Sealer Heat Seal Machine Poly Sealing Free Element Grip | Amazon | N/A | |
| water bath | VWR scientific | Model: 1166 | |
| BDW walk in plant growth chamber | Conviron | BDW 40 |
References
- Bennetzen, J. L., et al. Reference genome sequence of the model plant Setaria. Nat Biotechnol. 30, 555-561 (2012).
- Zhang, G., et al. Genome sequence of foxtail millet (Setaria italica) provides insights into grass evolution and biofuel potential. Nat Biotechnol. 30, 549-554 (2012).
- Li, P., Brutnell, T. P. Setaria viridis and Setaria italica, model genetic systems for the Panicoid grasses. J Exp Bot. 62, 3031-3037 (2011).
- Brutnell, T. P., et al. Setaria viridis: a model for C4 photosynthesis. Plant Cell. 22, 2537-2544 (2010).
- Doust, A. N., Kellogg, E. A., Devos, K. M., Bennetzen, J. L. Foxtail millet: a sequence-driven grass model system. Plant Physiol. 149, 137-141 (2009).
- Siles, M. M., Baltensperger, D. D., Nelson, L. A. Technique for artificial hybridization of foxtail millet [Setaria italica (L.) Beauv.]. Crop Sci. 41, 1408-1412 (2001).
- Li, H. W., Meng, C. J., Liu, T. N. Problems in the Breeding of Millet (Setaria Italica (L.) Beauv.). Agron. J. 27, 963-970 (1935).
- Willweber-Kishimoto, E. Interspecific relationships in the genus setaria. Contributions from the Biological Laboratory, Kyoto University. 14, 1-41 (1962).
- Chang, L. P. Studies on flowering and hybridization technique in Setaria. Nungyeh-hsueh Pao (Jour. Agric.) Act. Agric. Sin. 9, 68-76 (1958).
- Darmency, H., Pernes, J. Use of wild Setaria viridis (L.) Beauv. to improve triazine resistance in cultivated S. italica (L.) by hybridization. Weed Research. 25, 175-179 (1985).
- Sakai, S., Shin, C. Artificial hybridization of Setaria italica by hot water treatment. Bull. Fac. Agric. Kagoshima Univ. , 28-37 (1955).
- Malm, N. R., Rachie, K. O. . Setaria millets: A review of the world literature S.B. , 513-529 (1971).
- Miyaji, Y., Samura, T. The influence of atmospheric humidity on flowering and pollination in Setaria italica. Bull. Fac. Agric. Kagoshima Univ. , 1-6 (1954).
- Wang, Z. M., Devos, K. M., Liu, C. J., Wang, R. Q., Gale, M. D. Construction of RFLP-based maps of foxtail millet, Setaria italica (L.). P. Beauv. Theoret. Appl. Genetics. 96, 31-36 (1998).
- RangaswamiAyyangar, G. N., Narayanan, T. R., Seshadri Sarma, P. Studies in Setaria italica (Beauv.), the Italian millet. Part I. Indian J. Agr. Sci. , 561-571 (1933).
- Heh, C. M., Mei, T. F., Yang, S. S. Anthesis of Millet, Setaria Italica (L.) Beauv. Agron. J. 29, 845-853 (1937).
- Doust, A. N., Devos, K. M., Gadberry, M. D., Gale, M. D., Kellogg, E. A. The genetic basis for inflorescence variation between foxtail and green millet (poaceae). Genetics. 169, 1659-1672 (2005).
