Polarize İnsan Havayolu bir sıvı kaplı Kültürünün Oluşturulması Solunum Patojenler için Host Hücre Yanıtı Okumak Epitel Calu-3 Hücreler<em> In vitro</em

1. Transwell Kültürleri Kullanım için Kültürleme Calu-3 Hücreler Güvenlik Önlemleri: steril kültür tekniği kullanarak bir biyogüvenlik kabini tüm prosedürleri gerçekleştirin. Donmuş depolama hücreleri çözülme için: % 20 ısı ile inaktive edilmiş fetal bovin serumu (FBS), 0.1 mM temel olmayan amino asitler, 2 mM L-glutamin, and10 mM HEPES pH 7.4 (EMEM-% 20 + S) içeren Minimum Essential Eagle Medium hazırlayın. 37 ile steril filtre hazırlanmış bir 0.2 um gözenek boyutlu bir filtre kullanılmak üzere, orta, ve bir su banyosu içinde sıcak ° C. In situ havayolu epitel ortam içinde daha fazla yansıtıcı olmak için, antibiyotikler veya antimiyotikler orta ile desteklenmiş değildir. Bir 37 ° C su banyosu içinde hızla Calu-3 hücreleri (<1 dk), bir donmuş cryovial çözülme. 50 ml'lik steril konik tüpe çözülmüş hücreleri aktarın ve ısıtılmış EMEM +% 20-S, 30 ml eklemek 1,000-1,200 az 5 dakika süreyle santrifüj yoluyla topak hücrelere x g,soğutma olmadan ve düşük fren hızı ile. Nazikçe süpernatant süzün ve yavaşça aşağı yukarı ve pipetleme ile ısıtılmış EMEM +% 20-S, 5 ml içinde tekrar süspansiyon hücreleri. Tohum 2 ila 5 × 10 37 6-iyi doku kültürü plaka ve inkübe içine kuyu başına 6 hücre ° C, hücreler% 75 kadar hava atmosferinde% 7 CO 2 – 80% konfluent. Günlük olarak kontrol edin; 7 güne kadar gerekli olabilir. Her 3-4 günde hücrelerin medyumuyla aspire ve taze EMEM-% 20 + S. ile değiştirin : Altkültür hücreleri için Sıcak% 0.05 tripsin – 37 ° C su banyosunda% 0.02 EDTA. Fazla orta ve serum çıkarmak için% 0.02 EDTA – hücrelerin medyumuyla aspire ısıtılmış ve% 0.05 tripsin ile bir kere yıkayın hücrelerini. Yıkama çıkarın ve hücreler tripsin ısıtıldı kuyu başına 1 ml ekleyin. 37 ° C'de inkübe edin ve bir mikroskop altında% 7 CO2 ve monitör hücrelerin en azından% 75 doku kültür plakasının da (lar) dan ayırmak kadar her 5 dak. Bu olabilir5 ila 30 dakika sürer. Aşırı tripsin kaldırmak EMEM-% 20 + S hücreleri yıkayın. 50 ml'lik steril konik tüpe hücreler tripsinize aktarın. Bir 6-kültür plakasının bir hücre Çoklu kuyular ve bir steril 50 ml konik bir tüp içine toplanmış olabilir. Soğutma olmaksızın 1,000-1,200 santrifüje edilerek EMEM-% 20 + S ve pelet hücreler 30 ml x g, ekleme, ve düşük fren hızı ile. Yavaşça süpernatant Durusu ve hafifçe aşağı yukarı pipetleme ve taze olarak EMEM-% 20 + S hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin. 80% birleşik – onlar 75 arasında olduğunda 1.2.7 adımlarda 1.2.5 açıklandığı gibi doku kültür kaplarına altkültür hücrelere devam hücreleri Trypsinize için yukarıda 1.2.3 adımları 1.2.1. Yukarı 6-kuyulu plakanın iyi bir ikinci EMEM +% 20-S, 5 ml'lik bir nihai hacim içinde bir T-25 cm2 şişeye Alt kültür, 0.5 ila 1 x 10 6 hücre / şişeye arasında tohumlama. 5 ml kullanarak hücreleri, altkültür ayırmak için T-25 cm 2 balon başına tripsin ısındıbir T-25 cm2 şişeye yukarı bir ila EMEM +% 20-S, 10 ml'lik bir nihai hacim içinde T-75 cm2 şişeye, tohum 5-1 arasında x 10 6 hücre / flask. 8 ml Kullanımı 2 T-75 cm 2 şişeler içine bir T-75 cm 2 balon hücreleri, altkültür ayırmak için T-75 cm 2 balon başına tripsin ısındı. 3 yeni şişeler: Optimum hücre büyümesi için, alt kültür hücreleri 1 ebeveyn şişeyi daha büyük bir oranda T-75 cm 2 veya altkültür daha büyük ölçülü balona yok. Sonra hücreler ekilerek oylandı, tamamen kaldırmak ve% 75-90 izdiham ulaşıncaya kadar her 2 ila 3 gün orta değiştirin. Hücreler% 75-90 izdiham ulaşmak için 3 hafta kadar sürebilir. Polarize kültürler, alt kültür hücreleri bir tek tabaka olarak% 90 izdiham ötesinde büyümeye öncesi optimal kuşak için. Hücreleri yeterince tohum Transwell ekler istenilen sayıda büyüdü kadar altkültür hücreleri devam edin. Her Transwell insert 2 × 10 5 hücre gerektirir. Optimum performans polarize kültürler üretebilmek için, en fazla 10 altkültürler uğramıştır hücreleri kullanır. 2. Büyüyen Polarize Calu-3 Sıvı kaplı Kültürleri (LCC) Güvenlik Önlemleri: steril kültür tekniği kullanarak bir biyogüvenlik kabini tüm prosedürleri gerçekleştirin. 37 EMEM bir su banyosu içinde% 10 FBS (EMEM-% 10) ihtiva eden ve sıcak hazırlanması ° C. Tohumlama için 24-kuyu Transwell plaka hazırlayın. Steril forseps kullanarak, insert membran dokunmadan iç kısmından plakasının dış satırlara Transwell ekler taşıyın. Hücreler sadece plakanın dış satırlar üzerinde kuyu içine ekilerek olmalıdır. Bazolateral bölme içine hava kabarcıklarının girişini önlemek için, her bir bölme duvarına karşı pipet olta ve yavaş yavaş kuyuya orta serbest bırakarak, her biri için EMEM-% 10, 600 ul ilave edin. T-75 cm 2 doku hücreleri ayırın. SubcuLTURE şişeler ısıtıldı tripsin kullanılarak, ve-EMEM +% 20, adım 1.2 'de tanımlanan tripsinize hücreleri, her 2 şişeler başına S, 30 ml ile yıkanır. İyice hafifçe aşağı yukarı ve pipetleme ile EMEM-% 10, 5 mL içinde yıkanmış hücrelerin tekrar süspansiyon. Tripan mavi dışlama yöntemi ile uygulanabilir ve total hücre sayısı belirleyin. Yalnızca% 80 devam – 90% yaşayabilir. 50 ml'lik steril bir konik boru, 2'lik bir konsantrasyonda x EMEM-% 10 ile 10 6 canlı hücre / ml 'ye sulandırın hücre. Her Transwell ve apikal bölmeye hücreleri ekleyin. , Boşlukları, hücreleri olmadan EMEM-10% 100 ul ekleyin hücre içermeyen kontrol kuyuları, olacak kuyu A1 ve D1, için. Kalan kuyularının her biri için hafifçe uç duvarın iç kılavuz kanal karşı pipet olta ve yavaş yavaş salan hücreler, yeniden süspanse Calu-3 hücreler 100 ul ilave edin. Insert membrana pipet dokunmayın. Calu-3 hücrelerinin, homojen bir süspansiyon sağlamak için hafifçe ajite hücre süspansiyonuBu tohum çekilebilir. 37 ° C ve% 7 hava atmosferde CO 2 de inkübe Transwell plakası. Fiziksel rahatsızlık minimal olacaktır küvözde plakayı. Polarizasyon verimliliğini artırmak için, birbirlerinin üstüne tabak yığmayın. Polarize ve tamamen, deneylerinde kullanıma hazır olarak aşağıda 2.13 adımlarda 2.10 açıklandığı Transwells orta yerine kadar kültürleri korumak. Hücreleri tamamen polarize kadar Orta tamamen, önceki beslendikten sonra dördüncü ve sonra üçüncü gün arasında değişen bir döngü daha sonra üç gün Transwells içine ekilerek sonra değiştirilir, ve olmalıdır. Sıcak EMEM-10 37 ile bir su banyosu içinde% ° C. Yavaşça Transwell ekler orta aspire. Bir hafif vakumlu bir vakum tuzak bağlı bir kılcal pipet ile, ya da bir standart 1 ml birinci her kuyudan apikal orta kaldırma sonra pipet, hücre içermeyen kuyu A1 ve D1 aspirat orta taneli kuyulardan, ve ttavuk bütün kuyulardan bazolateral orta çıkarmadan. Orta aspire ederken insert membranlar dokunmayın. Pipet ucu kılavuz ucun yan kullanarak apikal bölmeye yönlendiren ortamı, daha sonra tohumlu kuyulara, hücre içermeyen kuyu A1 ve D1 apikal bölmeye EMEM-10% 200 ul ekle. Doğrudan hücreleri üzerine orta katmayın ve ekleme membran dokunmayın. Bazolateral bölmelere EMEM-% 10, 600 ul ekle. Bazolateral bölmeleri içine hava kabarcıkları girmesini önlemek için, her bölmenin duvara karşı pipet olta ve yavaş yavaş kuyunun içine orta bırakarak her biri orta ekleyin. 3. Calu-3 LCC Direnç Gelişimi Değerlendirilmesi Güvenlik Önlemleri: steril kültür tekniği kullanarak bir biyogüvenlik kabini tüm prosedürleri gerçekleştirin. Trans-epitelyal elektrik Calu-3 direnci (Teer) sonra LCC 30 dk Değerlendirinorta değişiklikler; eğer istenirse değerlendirme her bir ortam değişikliği yapılabilir. Steril koşullar altında ölçüm yapın. Bazal ölçümler elde etmek için hücre içermeyen kontrol kuyuları A1 ve D1 (boşluklar) ile ölçümler başlayın ve her iyi için ölçümler ile devam edin. Steril koşullar altında, steril su içinde% 70 etanol ihtiva eden 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne STX2 elektrot aktarmak ve 15 dakika sterilize edin. Kalibre ve üreticinin talimatlarına göre kullanıma voltohmmeter sınayın. Etanol, hava kurusu 5-10 sn elektrot çıkarın ve steril EMEM-% 10 ile elektrot durulayın. DİRENÇ ayara voltohmmeter şekli anahtarını ayarlayın ve gücü AÇIK konuma getirin. Bezin bir Transwell kültür bazolateral bölmesine erişim sağlayan 3 girişlerinden birine elektrot yerleştirin. Sıra elektrot yüzden artık kurşun yavaþca, dış kuyunun dibine dokunur ve dikey kalmasınıve kısa kurşun uç zar dokunmadan, apikal bölmesinin doku kültür ortamı içinde. "Tedbir R" düğmesine basın ve stabilize etmek için okuma için bekleyin. Her kuyucuk için diğer 2 bağlantı noktaları için tekrarlayın ve her üç limanlarından, kuyu başına üç ölçümün toplam ölçümleri kaydetmek. Hücrelerin bütün kuyuları için direncini ölçmek için devam edin. ,% 70 etanol içinde 5-10 dk iliklerine steril dH 2 O, durulama ve iyice kurutulması ile elektrot temizleyin. Orijinal ambalajında ​​saklayın. Eşitlik 1 kullanılarak, her bir kuyunun dayanıklılığını hesaplayın. Ω fiili = Ω örnek – Ω boş, Denklem 1 Ω numune seribaşı iyi ve Ω boş gelen ortalama ölçüm nerede ekler ve orta içeren 2 kuyu, A1 ve D1 ortalama ölçüm, ancak hiçbir hücredir. Denklemleri kullanılarak, birim alan direnç hesaplamation 2. Ω gerçek × efektif membran alanı = Ω × cm 2, Denklem 2 efektif membran alanı 24-kuyu Transwell uçlar için 0.33 cm 2 olduğu. Bu kutuplaşma esasına 02:59 Transwell kültürleri, apikal ve bazolateral bölmeleri arasında pasif sodyum fluorescein difüzyon ölçümü, ikinci bir tahlil yaparak tamamlandıktan doğrulayın. Sodyum fluoresein testi için kullanılan kuyu hemen tahlil tamamlanmasından sonra atılmalıdır. 4.75 mM KCl;; 2.53 mM CaCl 2 .2 H 2 O; 2.44 mM MgSO4; 1.19 mM KH 2 PO 4, 25 mM steril su içinde NaHCO 3; 0.45 mikron filtrasyon cihazı ile steril filtre (118 mM NaCl floresan olmayan tampon hazırlayın ). 4 ışıktan korunmalıdır ° C'de floresan olmayan tampon, steril filtre, alüminyum folyo ile sarın, ve mağaza içinde 1 mg / ml sodyum fluorescein hazırlayın. Oda sıcaklıkları için SıcakKullanmadan önce yeniden. Direnç ölçümleri tamamladıktan sonra, dikkatlice 02:59 bireysel Transwell kültürlerin bazolateral ve apikal bölümlerinde hem orta kaldırmak. Transwell kültürleri durulayın. Yavaşça apikal bölmelere bazolateral bölmeleri ve 100 ul oda sıcaklığında steril D-PBS 600 ul oda sıcaklığında steril Dulbecco PBS (D-PBS) ekleyin. Yavaşça kuyulardan D-PBS çıkarın. Bazolateral bölmelere 600 ul steril floresan olmayan tampon ekleyin. Apikal bölmelere 100 ul steril 1 mg / ml sodyum fluoresein ekleyin. 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe plaka. CO2 kuluçka sırasında bu gerekli değildir. İnkübasyon sırasında, sodyum floresein sulandırmak için floresan olmayan tampon kullanılarak, 20 ug / ml ve 0 ug / ml arasında değişen bir sodyum fluoresein standart bir eğri hazırlanır. En az 600 ul nihai hacim içinde sodyum fluoresein, en az 8 farklı konsantrasyonda, her hazırlayın. TutmakStandart eğri dilüsyonları absorbans ölçmek için hazır olana kadar ışıktan korunmalıdır. Her bir test Transwell arasında bazolateral bölme Analiz için bir temiz tüpe floresan olmayan tampon numune aktarın. Plaka pasif sodyum fluorescein difüzyon incelemek ve atmak için kullanılan test Transwells çıkarın. Inkübatör kalan Transwells ile plaka dönün. 96 çukurlu bir düz tabanlı plaka içine üç kopya halinde her bir standart çözelti 100 ul koyun. Floresan olmayan tampon içinde her bir bazolateral numunenin üç dilüsyonları (1:2, 1:20 ve 1:50) hazırlanması, ve içine, iki kopya halinde her bir sulandırılmamış numune seyreltme ve her biri 100 ul ekle bir 96-gözlü düz alt plaka. 486 nm veya 490 nm dalga boyunda ELISA plaka okuyucu Tedbir numune absorbansı. Floresein st için sodyum absorbans değerleri karşı örneklerin absorbans karşılaştırarak bazolateral bölme içinde sodyum fluoresein konsantrasyonunun belirlenmesiandard eğrisi. 4. Solunum Virüs ile birlikte polarize Calu-3 LCC Infecting Güvenlik Önlemleri: Virüs kullanılan uygun bir biyogüvenlik düzeyde steril kültür tekniği kullanarak bir biyogüvenlik kabini tüm prosedürleri gerçekleştirin. İstediğiniz inokulum 100 ul olurdu böylece serumsuz EMEM virüs seyreltin. Serumsuz EMEM hücreleri yıkayın. Yavaşça o bazolateral orta apikal orta kaldırarak, tüm kuyulardan orta aspire. Bir hafif vakumlu bir vakum tuzak bağlı bir kılcal pipet ile, ya da bir standart 1 ml pipet, hücre içermeyen kuyu A1 ve D1 aspirat orta, sonra ayrılmış kuyularda, her şeyden önce kuyusundan apikal orta kaldırma ve sonra kaldırma her kuyudan bazolateral ortamı. Orta aspire ederken insert membranlar dokunmayın. T sonra hücre içermeyen kuyuları A1 ve D1 apikal bölmeye serumsuz EMEM 100 ul ekleyin veO seribaşı kuyuları, pipet rehberlik etmek ucun tarafı kullanılarak apikal bölmeye orta yönetmenlik. Doğrudan hücreler üzerinde orta katmayın ve ekleme membran dokunmayın. Bazolateral bölmelere serumsuz EMEM 600 ul ekleyin. Bölmesinin duvara karşı pipet olta ve yavaş yavaş kuyunun içine orta bırakarak her Transwell orta ekleyin. Yavaşça kuyulardan serum orta aspire. Bulaşmamış veya mock-enfekte kuyuları ile başlayarak, Transwells ve apikal bölmeye uygun olan virüs dilüsyon ekleyin. Bulaşmamış kuyuları, mock-enfekte kuyuları için, uygun Transwells ve apikal bölmeye serumsuz EMEM 100 ul ekleyin uygun Transwells arasında apikal bölmeye serumsuz EMEM seyreltilir virüssüz hazırlık 100 ul ekleyin ve için virüs enfeksiyonu, serum serbest EMEM virüs sulandırmak ve uygun Transwells ve apikal bölmelere 100 ul ekleyin. Her bazolateral bölmelere serumsuz EMEM 600 ul ekle. 37 ° C'de inkübe edin ve 2 saat boyunca% 7 CO2. Sonra enfekte kuyulardan, ilk bulaşmamış ve mock-enfekte kuyulardan, kuyulardan orta aspire. Bazolateral süpernatantlar ardından ilk apikal süpernatantlar, çıkarın. Apikal bölmeleri ve bazolateral bölümlerinde EMEM-% 10 ve 600 ul içinde EMEM-% 10 ile 200 ul ortam değiştirin.