הקמת תרבות הנוזלית מכוסית של Airway האנושי המקוטב-3 Calu תאי אפיתל ללמוד תגובת תא מארחת לפתוגנים נשימה<em> במבחנה</em

1. -3 Calu תאי culturing לשימוש בתרבויות Transwell אמצעי בטיחות: ביצוע כל הפרוצדורות בארון בטיחות ביולוגית באמצעות טכניקת תרבות סטרילי. כדי להפשיר מתאי אחסון קפוא: הכן בינוני החיוני המינימאלי של הנשר המכיל 20% pH and10 mM HEPES 7.4 (20-EMEM% + S) סרום חום מומת עוברי שור (FBS), 0.1 חומצות אמינו לא חיוני מ"מ, 2 מ"מ L-גלוטמין,. סטרילית-מסנן בינוני המוכן באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר גודל נקבובי, וחם באמבט מים עד 37 ° C. להיות מהורהרים יותר של דרך אוויר בסביבת אפיתל אתר, בינוני לא השלים עם אנטיביוטיקה או antimycotics. הפשר cryovial קפוא של-3 Calu תאים במהירות (<דקות 1) באמבטית ° C 37 מים. להעביר את התאים הפשירו לצינור חרוטי מ"ל סטרילי 50 ולהוסיף 30 מ"ל של מחומם EMEM-20% + S. גלולת התאים על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב1,000-1,200 × g,ללא קירור, ועם מהירות בלם נמוכה. למזוג supernatant עדינות וresuspend התאים ב5 מ"ל של EMEM-20% מחוממים + S על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה. זרעים 2-5 × 10 6 תאים לכל היטב לתוך צלחת 6-גם רקמת תרבות ולדגור על 37 המעלות צלזיוס, CO 2 7% באווירת אוויר עד שהתאים הם 75% – 80% confluent. בדקו יומי; עד 7 ימים ייתכן שיידרשו. כל 3-4 ימים לשאוב הבינוניים מהתאים ולהחליף אותו טרי EMEM-20% + S. לתאים תת: 0.05% טריפסין חם – 0.02% EDTA באמבטית ° C 37 מים. לשאוב את המדיום מהתאים, ולשטוף את התאים פעם אחת עם טריפסין 0.05% מחוממים – 0.02% EDTA להסיר עודפים בינוניים וסרום. הסר לשטוף ולהוסיף 1 מ"ל של טריפסין חמם לכל גם לתאים. לדגור על 37 ° C ו 7% CO 2 ולפקח תחת מיקרוסקופ כל 5 דקות עד שלפחות 75% מתאים להתנתק מהבאר (הים) של צלחת תרבית הרקמה. זה עשויתיקח בין 5 ל 30 דקות. שטוף תאים ב- 20 EMEM% + S כדי להסיר טריפסין העודף. להעביר את תאי trypsinized לצינור חרוטי סטרילי 50 מ"ל. בארות רבות של תאים מצלחת התרבות 6 גם אחד יכולות להיות נקוות לתוך צינור אחד 50 מ"ל סטרילי חרוטים. הוסף 30 מ"ל של EMEM-20% + S וגלולת התאים על ידי צנטריפוגה ב1,000-1,200 × גרם, ללא קירור, ועם מהירות בלם נמוכה. למזוג supernatant עדינות וresuspend התאים בEMEM-20% טריים + S על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה. באמצעות צעדים 1.2.1 באמצעות 1.2.3 לעיל כדי trypsinize תאים, ימשיך תאים תת לתוך צלחות תרבית רקמה כמתואר בשלבים 1.2.5 באמצעות 1.2.7 כאשר הם בין 75 – confluent 80%. תת מטיפוס אחד המוכר היטב של צלחת 6-היטב עד 1 T-25 סנטימטר 2 בקבוק בנפח סופי של 5 מ"ל של EMEM-20% + S, זריעה בין 0.5-1 × 10 6 תאים / בקבוק. שימוש 5 מ"ל חמם טריפסין לT-25 2 סנטימטר בקבוק לנתק את התאים, תת תרבותמאחד 2 סנטימטר בקבוק T-25 עד 1 T 75-2 סנטימטר בקבוק בנפח סופי של 10 מ"ל של-20 EMEM% + S, זריעה בין 1 ל 5 × 10 6 תאים / בקבוק. באמצעות 8 מ"ל חמם טריפסין לT-75 סנטימטר 2 בקבוק לנתק את התאים, תת מאחד 2 בקבוק T-75 סנטימטר ל 2 T-75 2 צלוחיות סנטימטר. לצמיחת תאים אופטימליות, לא תאים תת לתוך צלוחיות גדולות יותר מסנטימטר T-75 2 או בתת יחס גדול יותר מבקבוק 1 הורה: 3 צלוחיות חדשות. ברגע שתאים כבר subcultured, להסיר לחלוטין ולהחליף את המדיום כל 2 עד 3 ימים עד שהם מגיעים מפגש 75-90%. תאים עשויים להימשך עד 3 שבועות כדי להגיע לנקודת מפגש 75-90%. עבור דור האופטימלי של תרבויות מקוטבות, תאים תת לפני שהם יגדלו מעבר למפגש 90% כmonolayer. המשך לתאים תת עד מספיק תאי זרע גדלו מספר הרצוי של Transwell מוסיף. כל הוספת Transwell דורשת 2 × 10 5 תאים. לקבלת ביצועים מיטביים יצירת תרבויות מקוטבות, להשתמש בתאים שעברו לא יותר מ 10 תת תרבות. 2. -3 Calu תרבויות מקוטבות גידול נוזלי מכוסות (LCC) אמצעי בטיחות: ביצוע כל הפרוצדורות בארון בטיחות ביולוגית באמצעות טכניקת תרבות סטרילי. הכן EMEM המכיל 10% FBS (EMEM-10%) וחם באמבט מים עד 37 ° C. הכן צלחת Transwell 24 גם לזריעה. שימוש במלקחיים סטריליים, להעביר מוסיף Transwell מהפנים אל השורות החיצוניות של הצלחת בלי לגעת בקרום להוסיף. תאים צריכים להיות subcultured רק לתוך בארות בשורות החיצוניות של הצלחת. כדי למנוע החדרת בועות אוויר אל תאי basolateral, להוסיף 600% μl של EMEM-10 לכל אחד מהם על ידי מטה את פיפטה על הקיר של כל תא ומשחרר את המדיום באיטיות לתוך הבאר. ניתוק מתאי T-75 2 רקמות סנטימטר. Subcuצלוחיות lture באמצעות טריפסין חמם, ולשטוף ב30 מ"ל של-20 EMEM% + S לכל 2 צלוחיות של תאי trypsinized, כפי שמתוארים בשלב 1.2. יסודיות resuspend התאים השטופים ב5 מ"ל של% EMEM-10 על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה. קבע ספירת תאי קיימא וכוללת בשיטת ההדרה הכחולה trypan. להמשיך רק אם 80% – 90% הם בנות קיימא. בצינור חרוטים 50 מ"ל סטרילי, לדלל את התאים לריכוז של 2 × 10 6 תאים / מיליליטר קיימא עם% EMEM-10. הוסף תאים לתא האפיקלי של כל Transwell. לבארות A1 ו D1, אשר יהיו בארות בקרה סלולרית חינם, כלומר, חסרים, להוסיף 100 μl של EMEM-10% ללא תאים. לכל אחת מהבארות שנותרו, להוסיף 100 μl של-3 Calu תאי resuspended, עדינות לדוג פיפטה נגד ערוץ המדריך הפנימי של הקיר להוסיף ומשחרר את התאים לאט. אל תיגע בפיפטה לממברנה להוסיף. כדי לשמור על השעיה הומוגנית של-3 Calu תאים, בעדינות להתסיס השעית התאבמהלך שלב זה זריעה. צלחת דגירת Transwell על 37 מעלות צלזיוס ו% 7 CO 2 באטמוספרת אוויר. צלחת מקום בחממה שבו הפרעה פיזית תהיה מינימאלית. כדי לשפר את היעילות של קיטוב, אל תערמו צלחות על גבי זה. כדי לשמור על תרבויות עד מקוטב ומוכן לשימוש בניסויים, להחליף לחלוטין בינוני בTranswells, כמתואר בשלבים 2.10 דרך 2.13 להלן. בינוני יש להחליף לחלוטין שלושה ימים לאחר שsubcultured לTranswells, ולאחר מכן במחזור לסירוגין בין היום הרביעי ואז השלישי לאחר ההאכלה הקודמת, עד שתאים הם מקוטבים באופן מלא. חם EMEM-10% באמבט מים עד 37 ° C. בעדינות לשאוב בינוני ממוסיף Transwell. עם פיפטה נימים מצורפות למלכודת ואקום עם ואקום עדין, או עם תקן המ"ל פיפטה 1, בינוני aspirate מהבארות A1 תא חינם וD1, אז מseeded בארות, הסרה בינוני פסגה ראשונה מכל הבארות, ולאתרנגולת הסרה בינונית basolateral מכל הבארות. אל תיגעו קרומים להוסיף תוך aspirating בינוני. הוסף 200% μl של EMEM-10 לתא הקודקוד של הבארות A1 תא חינם וD1, ולאחר מכן לseeded הבארות, בימוי הבינוני לתוך התא האפיקלי באמצעות הצד של הכנסה כדי להנחות את קצה פיפטה. אל תוסיף בינוני ישירות על גבי תאים, ולא נוגע בקרום להוסיף. הוסף 600% μl של EMEM-10 לתאי basolateral. כדי למנוע החדרת בועות אוויר אל תאי basolateral, להוסיף את המקור לכל אחד מהם על ידי מטה את פיפטה על הקיר של כל תא ומשחרר את המדיום באיטיות לתוך הבאר. 3. הערכת התפתחות התנגדות של Calu-3 LCC אמצעי בטיחות: ביצוע כל הפרוצדורות בארון בטיחות ביולוגית באמצעות טכניקת תרבות סטרילי. הערך את התנגדות החוצה אפיתל חשמלית (TEER) של Calu-3 30 דקות לאחר LCCשינויים בינוניים; ההערכה ניתן לבצע לאחר כל שינוי בינוני אם ירצה. לבצע מדידות בתנאים סטריליים. בגין מדידות עם שליטת תא חינם בארות A1 ו D1 (את החסר) להשיג מידות בסיסיות, ולהמשיך במדידה של כל טובה. בתנאים סטריליים, להעביר את האלקטרודה STX2 לצינור צנטריפוגה 50 מ"ל המכיל 70% אתנול במים סטריליים, ולעקר 15 דקות. לכייל ולבדוק voltohmmeter לשימוש בהתאם להוראות יצרן. הסר את האלקטרודה מאתנול, אוויר יבשות שניות 5-10, ולשטוף את האלקטרודה ב% סטרילי EMEM-10. הגדר את מתג המצב של voltohmmeter להגדרת ההתנגדות, ולהפוך את הכח על. מניח בעדינות את האלקטרודה לאחד 3 היציאות המאפשרות גישה לתא basolateral של תרבות אחת Transwell. האלקטרודה מקום, כך שכבר הוביל בקלילות רק יגעה בתחתית גם החיצוני ונשארה אנכי,ולהוביל הקצרים הוא בטווח הבינוני תרביות הרקמה של התא האפיקלי, בלי לגעת בקרום להוסיף. לחץ על כפתור "מדוד R", ולחכות לקריאה לייצוב. חזור עבור 2 יציאות האחרות לכל באר ולהקליט את המדידות מכל השלוש היציאות, עבור סכום כולל של שלוש מדידות לטובות. המשך למדוד את ההתנגדות לכל הבארות של תאים. נקה את האלקטרודה על ידי שריית דקות 5-10 באתנול 70%, שטיפה בDH 2 O סטרילי, וייבוש ביסודיות. אחסן במכל המקורי. חשבתי את ההתנגדות של כל אחד וכן, באמצעות משוואה 1. Ω = Ω בפועל מדגם – Ω ריק, משוואת 1 בי מדגם Ω הוא המדידה הממוצעת מseeded היטב וΩ ריק היא מדידה ממוצעת מ2 הבארות, A1 ו-D1, המכילה מוסיף ובינוני, אך לא תאים. חשבתי את התנגדות יחידת השטח, תוך שימוש בEquation 2. בפועל Ω × שטח הממברנה יעילה = Ω × 2 סנטימטר, משוואת 2 שבו שטח הממברנה היעיל הוא 0.33 סנטימטר 2 למוסיף Transwell 24 כן. ודא קיטוב שהושלם על ידי ביצוע בדיקה משנית, מדידת דיפוזיה fluorescein נתרן פסיבית בין תאי apical וbasolateral, על 1-3 תרבויות Transwell. הבארות המשמשות לבדיקת fluorescein נתרן אמורות להיות מושלכות מייד לאחר השלמת הבדיקה. הכן את החיץ הלא ניאון (118 mM NaCl, 4.75 mM KCl; 2.53 mM CaCl 2 0.2 H 2 O; 2.44 mM MgSO 4; 1.19 mM KH 2 PO 4, 25 מ"מ 3 NaHCO במים סטריליים; סינון סטרילי עם מכשיר סינון מיקרומטר 0.45 ). הכן fluorescein נתרן ב1 ​​מ"ג / מ"ל ​​בחיץ שאינו ניאון, סינון סטרילי, עוטפים בנייר כסף, וחנות ב 4 ° C, מוגן מפני אור. חם לחדר temperatuמחדש לפני השימוש. לאחר שסיים את המדידות של התנגדות, להסיר בזהירות בינונית משני תאי basolateral וקודקוד של 1-3 תרבויות Transwell בודדות. שטוף תרבויות Transwell. בעדינות להוסיף 600 μl טמפרטורת חדר PBS של סטרילי Dulbecco (D-PBS) לתאי basolateral ו100 μl טמפרטורת חדר סטריליים D-PBS לתאי apical. בעדינות להסיר D-PBS מבארות. הוסף 600 חיץ הלא ניאון הסטרילי μl לתאי basolateral. הוסף fluorescein 100 μl סטרילי 1 מ"ג / מיליליטר נתרן לתאי apical. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. CO 2 אינו נדרש במהלך דגירה זה. במהלך דגירה, להכין עקומת נתרן fluorescein סטנדרטי נעה בין 20 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו 0 מיקרוגרם / מ"ל, באמצעות חיץ הלא ניאון לדלל fluorescein נתרן. הכן לפחות 8 ריכוזים שונים של fluorescein נתרן, כל אחד בנפח סופי של לפחות 600 μl. לשמורדילולי עקומת סטנדרט מוגנים מפני אור עד מוכן למדידת ספיגה. להעביר את מדגם החיץ הלא ניאון מתא basolateral של כל Transwell בדיקה לצינור נקי נפרד לניתוח. הסר את מבחן Transwells משמש כדי לבחון דיפוזיה fluorescein נתרן פסיבית מהצלחת וזורקים. להחזיר את הצלחת עם Transwells שנותר לחממה. הנח 100 μl של כל פתרון סטנדרטי בשלושה עותקים לצלחת 96-היטב שטוחה תחתית. הכן 3 דילולים של כל דגימת basolateral (1:2, 1:20, ו01:50) במאגר שאינו ניאון, ולהוסיף 100 μl של כל דגימת דילול מלאה ובכל דילול, בשני עותקים, ל96-היטב שטוח צלחת תחתונה. ספיגת מדגם מידה על קורא צלחת ELISA ב486 מייל ימי או 490 ננומטר. לקבוע את הריכוז של fluorescein נתרן בתא basolateral על ידי השוואת דגימות הספיגה כנגד ערכי הספיגה לנתרן fluorescein stעקומת andard. 4. מדביק Calu-3 המקוטבים LCC עם וירוס בדרך נשימה אמצעי בטיחות: ביצוע כל הפרוצדורות בארון בטיחות ביולוגית באמצעות טכניקה סטרילית תרבות, ברמת בטיחות ביולוגית מתאימה לוירוס בשימוש. דלל וירוס בEMEM סרום נטול כך שinocula הרצוי יהיה ב100 μl. שטוף תאים בEMEM סרום חינם. בעדינות לשאוב בינוני מכל הבארות, הסרה בינוני קודקוד אז בינוני basolateral. עם פיפטה נימים מצורפות למלכודת ואקום עם ואקום עדין, או עם תקן המ"ל פיפטה 1, בינוני aspirate מהבארות A1 תא חינם וD1, אז מseeded בארות, להסיר תחילה בינוני קודקוד מכל הבארות, ולאחר מכן להסיר הבינוני basolateral מכל הבארות. אל תיגעו קרומים להוסיף תוך aspirating בינוני. הוסף 100 μl של EMEM סרום נטול לתא הקודקוד של הבארות A1 תא חינם וD1, ולאחר מכן ל-tהוא seeded בארות, בימוי בינוני לתוך התא האפיקלי באמצעות הצד של הכנסה כדי להנחות את קצה פיפטה. אל תוסיף בינוני ישירות על תאים, ולא נוגע בקרום להוסיף. הוסף 600 μl של EMEM סרום נטול לתאי basolateral. הוסף לכל מדיום Transwell ידי לדוג פיפטה על הקיר של התא ומשחרר את המדיום באיטיות לתוך הבאר. בעדינות לשאוב בינוני סרום ללא מבאר. מתחיל עם בארות נגועות או מדומה-נגועות, להוסיף דילולי וירוס מתאימים לתא הקודקוד של Transwells. לבארות נגועות, להוסיף 100 μl של EMEM סרום נטול לתא הקודקוד של Transwells המתאים, לבארות מדומה נגועות, להוסיף 100 μl הכנת וירוס ללא דילול בEMEM סרום נטול לתא הקודקוד של Transwells המתאים, ועבור הידבקות בוירוס, לדלל את הווירוס בEMEM סרום חופשי, ומוסיפה 100 μl לתאי apical של Transwells המתאים. הוסף 600 μl של EMEM סרום חופשי לכל מדורי basolateral. לדגור על 37 ° C ו-CO 2% 7 עבור 2 שעות. לשאוב בינוני מבאר, ראשון מבארות נגועות ומדומה-נגועות, אז מבארות נגועות. הסר supernatants 1 apical, ואחרי supernatants basolateral. החלף בינוני עם 200% μl של EMEM-10 בתאי apical ו600 μl של EMEM-10% בתאי basolateral.