Estabelecer uma cultura líquida, coberta de vias respiratórias humanas epiteliais Polarized Calu-3 células para estudar a resposta Cell Host para patógenos respiratórios<em> In vitro</em

1. Cultura Calu-3 células para uso em culturas Transwell Medidas de segurança: Realizar todos os procedimentos em um armário de biossegurança utilizando a técnica de cultura estéril. Para descongelar as células de armazenamento de congelados: Prepare Meio Mínimo Essencial de Eagle contendo 20% inactivado pelo calor de soro fetal bovino (FBS), 0,1 mM de não-aminoácidos essenciais, 2 mM de L-glutamina, e 10 mM de HEPES pH 7,4 (EMEM-20% + S). Esterilizada por filtro de média a preparada utilizando um filtro de 0,2 um de tamanho de poro, e aquecido num banho de água a 37 ° C. Para ser mais reflectora do ambiente em situ das vias aéreas epitélio, o meio não é suplementado com antibióticos ou antimicóticos. Descongelar um criotubo gelado de células Calu-3 rapidamente (<1 min) num banho de água a 37 ° C. Transferir as células descongeladas a um tubo de 50 ml estéril cónico e adicionar 30 ml de EMEM-aquecido a 20% + S. Pellet as células por centrifugação durante 5 min a 1,000-1,200 × g,sem refrigeração, e com uma velocidade baixa de freio. Decantar o sobrenadante cuidadosamente e ressuspender as células em 5 ml de EMEM-20% + S aquecido suavemente pipetando para cima e para baixo. Semente 2-5 x 10 6 células por poço numa placa de cultura de tecidos de 6 poços e incuba-se a 37 ° C, 7% CO 2 em ar ambiente até que as células são de 75% – 80% confluentes. Verifique diariamente; até 7 dias podem ser necessários. A cada 3-4 dias, aspirar o meio das células e substitui-lo com EMEM fresco, 20% + S. Para subcultura de células: 0,05% de tripsina quente – 0,02% de EDTA em um banho de água a 37 ° C. Aspirar o meio das células, uma vez que as células e lava-se com tripsina a 0,05% aquecida – EDTA a 0,02% para remover o excesso de meio e soro. Remover a solução de lavagem e adicionar 1 ml de tripsina aquecido por poço para as células. Incubar a 37 ° C e CO 2, e 7% de monitor sob um microscópio a cada 5 min até que pelo menos 75% das células destacam do poço (s) da placa de cultura de tecidos. Isso podeter entre 5 e 30 min. Lave as células em EMEM-20% + S para remover o excesso de tripsina. Transferir as células tripsinizadas em um tubo de 50 ml estéril cónico. Múltiplos poços de células a partir de uma placa de cultura de 6 poços podem ser reunidos numa única tubo estéril de 50 ml de Erlenmeyer. Adicionar 30 ml de células de EMEM a 20% +-S e de sedimento por centrifugação a 1,000-1,200 × g, sem refrigeração, e com uma velocidade baixa de freio. Decantar o sobrenadante com cuidado e ressuspender as células em% EMEM-20 fresco + S cuidado pipetando para cima e para baixo. Usando etapas 1.2.1 1.2.3 acima através de Tripsinizar as células, as células continuarão a subcultura em placas de cultura de tecidos, tal como descrito nos passos 1.2.5 1.2.7 através quando estão entre 75 – 80% confluentes. Subcultura a partir de um poço de uma placa de 6 poços até um T-25 centímetros balão 2, num volume final de 5 ml de EMEM a 20% +-S, semeando entre 0,5 a 1 x 10 6 células / frasco. Usando 5 ml de tripsina aquecido por T de 25 cm 2 balão para separar células de subcultura,a partir de um frasco de T-25 cm2 até um T-75 cm 2 balão num volume final de 10 ml de EMEM a 20% +-S, semeando entre 1 e 5 x 10 6 células / frasco. Utilizando 8 ml de tripsina aquecido por T de 75 cm 2 balão para separar células de subcultura, a partir de um T-75 cm 2 em 2 frasco T-75 cm 2 frascos. Para o crescimento celular óptimo, não se células de subcultura em frascos maiores do que T-75 cm 2 ou subcultura a uma proporção maior do que um frasco de pai: 3 frascos novos. Uma vez que as células foram subcultivadas, remover completamente e substitua meio a cada 2 a 3 dias até atingirem a confluência de 75-90%. As células podem levar até 3 semanas para chegar a confluência de 75-90%. Para a geração óptima de culturas polarizadas, células de subcultura antes que crescem para além de 90% de confluência como uma camada única. Continue a células de subcultura até um número suficiente de células cresceram até o número desejado de sementes de inserções Transwell. Cada pastilha Transwell requer 2 × 10 5 células. Para um desempenho ideal gerando culturas polarizadas, utilize células que sofreram mais de 10 subculturas. 2. Crescimento polarizado Calu-3 líquido cobertas de Culturas (LCC) Medidas de segurança: Realizar todos os procedimentos em um armário de biossegurança utilizando a técnica de cultura estéril. Prepare EMEM contendo FBS a 10% (EMEM-10%) e aquecido num banho de água a 37 ° C. Prepare uma placa de 24 poços Transwell para a semeadura. Utilizando fórceps estéreis, mover inserções Transwell do interior para as linhas exteriores da placa, sem tocar na membrana de inserção. As células devem ser subcultivadas apenas em poços sobre as linhas exteriores da placa. Para evitar a introdução de bolhas de ar nos compartimentos basolateral, adicionar 600 uL de EMEM a 10%, para cada uma a dobrar a pipeta contra a parede de cada compartimento e, lentamente, libertar o suporte para dentro do poço. Separar as células T a partir de 75 cm 2 de tecido. Subcufrascos LTURE utilizando tripsina aquecido, e lavar com 30 ml de EMEM-20% + S por cada 2 frascos de células tripsinizadas, tal como descrito no passo 1.2. Completamente ressuspender as células lavadas em 5 ml de EMEM a 10%, com cuidado pipetando para cima e para baixo. Determinar a contagem de células viáveis ​​e total pelo método de exclusão de azul de tripano. Prossiga apenas se a 80% – 90% são viáveis. Num tubo de 50 ml estéril cónico, diluir as células a uma concentração de 2 x 10 6 células viáveis ​​/ ml, com EMEM-10%. Adicionar células para o compartimento apical de cada Transwell. Para poços A1 e D1, o qual será poços de controlo isentos de células, isto é, espaços em branco, adicionar 100 uL de EMEM a 10%, sem células. Para cada uma das cavidades restantes, adicionar 100 ul de ressuspensos Calu-3 células, gentilmente dobrando a pipeta contra o canal de guia interior da parede da inserção e, lentamente, libertando as células. Não toque a pipeta para a membrana de inserção. Para manter uma suspensão homogénea de células Calu-3, agite suavemente a suspensão de célulasdurante este passo de semeadura. Incubar a placa Transwell a 37 ° C e 7% CO 2 em ar atmosférico. Coloque a placa em uma incubadora onde perturbação física será mínimo. Para melhorar a eficiência de polarização, não se acumulam chapas em cima uns dos outros. Para manter as culturas até polarizado e pronto para uso em experimentos, substituir completamente no meio transwells, como descrito nos passos a 2,10 2,13 a seguir. Meio deve ser completamente substituído três dias depois de ter sido subcultivados em transwells, e, em seguida, em um ciclo alternado entre o quarto dia e, em seguida, após a terceira alimentação anterior, até que as células são totalmente polarizado. Quente EMEM-10% em um banho de água a 37 ° C. Aspirar cuidadosamente meio de inserções Transwell. Com uma pipeta capilar ligado a uma armadilha de vácuo com um vácuo suave, ou com um padrão de pipeta de 1 ml, o meio aspirado a partir de células livres de poços A1 e D1, em seguida, a partir de poços semeados, antes de remover o meio apical de todos os poços, e tgalinha de remover o meio basolateral de todos os poços. Não toque membranas inserção enquanto aspiração médio. Adicionar 200 uL de EMEM a 10%, para o compartimento apical de células livres de poços A1 e D1, em seguida, aos poços semeados, dirigindo o meio no compartimento apical usando o lado da inserção para guiar a ponta da pipeta. Não adicione médio diretamente sobre as células, e não tocar a membrana de inserção. Adicionar 600 uL de EMEM a 10%, para os compartimentos basolateral. Para evitar a introdução de bolhas de ar nos compartimentos basolateral, adicionar meio de cada um por dobrar a pipeta contra a parede de cada compartimento e, lentamente, libertar o suporte para dentro do poço. 3. Avaliação do Desenvolvimento da Resistência Calu-3 LCC Medidas de segurança: Realizar todos os procedimentos em um armário de biossegurança utilizando a técnica de cultura estéril. Trans-epitelial avaliar a resistência eléctrica (TEER) de Calu-3 LCC 30 min depoismudanças médio, a avaliação pode ser realizada após cada mudança de meio, se desejar. Realizar medições em condições estéreis. Comece medições com o controle livre de células poços A1 e D1 (os espaços em branco) para obter medidas de base, e continuar com as medidas para cada poço. Sob condições estéreis, transferir o eléctrodo STX2 para um tubo de centrífuga de 50 ml contendo 70% de etanol em água estéril, e esterilizar 15 min. Calibrar e testar o voltohmmeter para uso de acordo com as instruções do fabricante. Retire o eletrodo a partir do etanol, o ar seco 5-10 segundos, e enxaguar o eletrodo com% EMEM-10 estéril. Defina o modo do voltohmmeter para a definição de resistência, e ligar o rádio. Coloque suavemente o eléctrodo numa das três portas que permitem o acesso ao compartimento basolateral de uma cultura Transwell. Eléctrodo lugar de modo que o fio mais apenas tocar levemente na parte inferior do poço e exterior permanece vertical,e o mais curto é no meio de cultura de tecido do compartimento apical, sem tocar na membrana de inserção. Push "Medida R" botão, e aguarde a leitura estabilize. Repetir para as outras duas portas de cada poço e registar as medições de todos os três portas, para um total de três medições por poço. Continuar a medir a resistência de todos os poços de células. Limpar o eléctrodo por imersão 5-10 min em etanol a 70%, enxaguando em dH2O estéril, e secagem cuidadosamente. Conservar na embalagem original. Calcula-se a resistência de cada poço, usando a Equação 1. Ω = Ω amostra real – Equação Ω em branco, 1 onde a amostra Ω é a medição média de um poço e semeado em branco Ω é a medição média da 2 poços, A1 e D1, contendo inserções e médios, mas sem células. Calcular a resistência por unidade de área, utilizando Equação 2. Ω real × área efectiva de membrana Equação = Ω × cm 2, 2 em que a área efectiva da membrana é de 0,33 cm 2 para inserções Transwell de 24 cavidades. Verificar que a polarização é completa através da realização de um ensaio secundário, medindo a difusão passiva de fluoresceína de sódio entre os compartimentos apical e basolateral, em 1-3 culturas Transwell. Os poços utilizados para o ensaio de fluoresceína de sódio deverá ser descartado imediatamente após a conclusão do ensaio. Preparar tampão não fluorescente (118 mM NaCl; 4,75 mM KCl, 2,53 mM de CaCl 2 .2 H 2 O; 2,44 mM MgSO 4, 1,19 mM KH 2 PO 4, 25 mM de NaHCO3 em água estéril; filtro estéril com 0,45 uM dispositivo de filtração ). Prepare fluoresceína de sódio a 1 mg / ml em tampão não fluorescente, o filtro esterilizado, envoltório em folha de alumínio, e armazenar a 4 ° C, protegidos da luz. Quente para o quarto de temperature antes da utilização. Depois de completar as medições de resistência, remova cuidadosamente médio de ambos os compartimentos basolateral e apical de um a três culturas individuais Transwell. Lavar culturas Transwell. Suavemente adicionar 600 ul à temperatura ambiente estéril PBS Dulbecco (D-PBS) para os compartimentos basolateral e 100 uL à temperatura ambiente estéril D-PBS para os compartimentos apicais. Remova cuidadosamente D-PBS dos poços. Adicionar 600 ul de tampão não fluorescente estéril para os compartimentos basolateral. Adicionam-se 100 ul de uma estéril de fluoresceina de sódio mg / ml para os compartimentos apicais. Incubar a placa a 37 ° C durante 1 h. CO 2 não é necessário durante a incubação. Durante a incubação, preparar uma curva padrão de fluoresceína de sódio que varia entre 20 ng / ml e 0 ng / mL, utilizando tampão não fluorescente para diluir fluoresceína de sódio. Preparar pelo menos 8 concentrações diferentes de fluoresceína de sódio, cada um em um volume final de, pelo menos, 600 ul. Manterdiluições da curva padrão protegido da luz até que esteja pronto para medir a absorbância. Transfira a amostra tampão não fluorescente a partir do compartimento basolateral de cada Transwell de teste para um tubo limpo separado para análise. Remover o teste transwells usado para examinar a difusão passiva de fluoresceína de sódio a partir da placa e descartar. Regressar a placa com transwells restantes para a incubadora. Coloque 100 ul de cada solução padrão em triplicado numa placa de 96 poços de fundo plano. Preparar três diluições de cada amostra basolateral (1:2, 1:20, e 1:50) em tampão não fluorescente, e adicionar 100 uL de cada amostra não diluída e de cada uma das diluições, em duplicado, para um de 96 poços plana placa de fundo. Absorvância medida da amostra num leitor de placas de ELISA a 486 nm ou 490 nm. Determinar a concentração de fluoresceina de sódio no compartimento basolateral através da comparação da absorvância das amostras contra os valores de absorvância para a fluoresceína sódica standard curva. 4. Infectando Polarized Calu-3 LCC com Vírus Respiratório Medidas de Segurança: executar todos os procedimentos descritos em uma cabine de segurança biológica utilizando a técnica de cultura estéril, a um nível apropriado de segurança biológica para o vírus a ser utilizado. Diluir vírus em EMEM livre de soro, de modo que seria desejado inóculos em 100 ul. Lave as células em EMEM livre de soro. Aspirar cuidadosamente meio de todos os poços, o meio de remoção apical então o meio basolateral. Com uma pipeta capilar ligado a uma armadilha de vácuo com um vácuo suave, ou com um padrão de pipeta de 1 ml, o meio aspirado a partir de células livres de poços A1 e D1, em seguida, a partir de poços semeados, em primeiro lugar remoção do meio apical de todos os poços, e em seguida removendo o meio basolateral de todos os poços. Não toque membranas inserção enquanto aspiração médio. Adicionar 100 uL de EMEM livre de soro para o compartimento apical de células livres de poços A1 e D1, e depois a tele seeded poços, dirigindo meio no compartimento apical usando o lado da inserção para guiar a ponta da pipeta. Não adicione meio diretamente sobre as células, e não tocar a membrana de inserção. Adicionar 600 uL de EMEM livre de soro para os compartimentos basolateral. Adicionar meio de cada Transwell pela angulação da pipeta contra a parede do compartimento e, lentamente, libertar o suporte para dentro do poço. Aspirar cuidadosamente meio isento de soro dos poços. Começando com os poços não infectadas ou falsamente infectadas, adicionar as diluições de vírus apropriadas para o compartimento apical do transwells. Para poços não infectados, adicionar 100 uL de EMEM livre de soro para o compartimento apical do transwells apropriados, por falsamente infectadas poços, adicionar 100 ul de vírus livre de preparação diluída em EMEM livre de soro para o compartimento apical do transwells adequadas, por infecção por vírus, vírus diluído em EMEM livre de soro e adicionar 100 ul para os compartimentos apicais de transwells apropriados. Adicionar 600 uL de EMEM livre de soro de todos os compartimentos basolateral. Incubar a 37 ° C e 7% CO 2, durante 2 horas. Aspirar meio de poços, em primeiro lugar a partir de poços não infectados e falsamente infectadas, em seguida, a partir de poços infectados. Remover sobrenadantes apicais primeiro lugar, seguido por sobrenadantes basolateral. Substituir meio com 200 uL de EMEM a 10%, nos compartimentos apicais e 600 uL de EMEM a 10%, nos compartimentos basolateral.