Aufbau einer Liquid-bedeckten Kultur Polarized Menschliche Airway Epithelial Calu-3-Zellen, um Host-Zell-Antwort, um Atemwegspathogene Studie<em> In-vitro-</em

Ein. Kultivierung Calu-3 Zellen zur Verwendung in Transwell Kulturen Sicherheitshinweise: Führen Sie alle in einer biologischen Sicherheitswerkbank mit sterilen Kultur Technik. Um Zellen aus Gefrierlagerung auftauen: Planen Eagles Minimum Essential Medium mit 20% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS), 0,1 mM nicht-essentielle Aminosäuren, 2 mM L-Glutamin, und 10 mM HEPES pH 7,4 (EMEM-20% + S). Sterile-Filter das vorbereitete Medium unter Verwendung eines 0,2 &mgr; m Porengröße Filter, und warm in einem Wasserbad auf 37 ° C. Genauer reflektierende des in situ Atemwegsepithel Umgebung wird Mediums nicht mit Antibiotika oder Antimykotika ergänzt. Auftauen eine gefrorene Kryoröhrchen von Calu-3-Zellen schnell (<1 min) in einem 37 ° C Wasserbad. Übertragen der aufgetauten Zellen auf eine 50 ml sterile konische Röhre und 30 ml erwärmten EMEM-20% + S. Pelletieren der Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 1000-1200 × g,ohne Kühlung und mit geringem Steuerdruck Geschwindigkeit. Den Überstand umfüllen sanft und die Zellen in 5 ml erwärmter EMEM-20% + S durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren. Seed 2 bis 5 × 10 6 Zellen pro Vertiefung in einer 6-Well Gewebekulturplatte und bei 37 ° C, 7% CO 2 in Luft-Atmosphäre, bis die Zellen 75% – 80% konfluent. Überprüfen Sie täglich, bis zu 7 Tage erforderlich sein. Alle 3-4 Tage saugen das Medium aus den Zellen und ersetzen Sie es mit frischen EMEM-20% + S. Um Subkultur Zellen: Warm 0,05% Trypsin – 0,02% EDTA in einem 37 ° C warmen Wasserbad. Absaugen Mediums von den Zellen und wäscht die Zellen einmal mit 0,05% Trypsin erwärmte – 0,02% EDTA, um überschüssiges Medium und Serum zu entfernen. Entfernen Sie die Wasch-und 1 ml erwärmt Trypsin pro Well zu den Zellen. Bei 37 ° C und 7% CO 2 und unter einem Mikroskop Monitor alle 5 min, bis mindestens 75% der Zellen aus der Wanne (n) der Gewebekulturplatte abzulösen. Dies kannnehmen zwischen 5 und 30 min. Waschen der Zellen in EMEM-20% + S, um überschüssiges Trypsin zu entfernen. Übertragung der Zellen auf eine trypsinisierte 50 ml sterile konische Röhre. Mehrere Vertiefungen von Zellen aus einer 6-Well-Kulturplatte können in ein steriles 50 ml konischen Röhrchen gepoolt werden. 30 ml EMEM-20% + S und Pellet der Zellen durch Zentrifugation bei 1000-1200 xg, ohne Kühlung, und mit geringem Bremsgeschwindigkeit. Den Überstand umfüllen sanft und die Zellen in frischem EMEM-20% + S durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren. Mit Schritte 1.2.1 bis 1.2.3 oben, um Zellen trypsinieren weiterhin Subkultur Zellen in Zellkulturschalen wie in den Schritten 1.2.5 bis 1.2.7 beschrieben, wenn sie zwischen 75 sind – 80% konfluent. Subkultivierung von einem Well einer 6-Well-Platte bis zu einem T-25-cm 2-Kolben, in einem Endvolumen von 5 ml 20%-EMEM + S, Säen zwischen 0,5 bis 1 × 10 6 Zellen / Kolben. Mit 5 ml erwärmt Trypsin pro T-25 cm 2-Kolben, um Zellen, Subkultur lösenaus einem T-25-cm 2-Kolben bis zu einem T-75-cm 2-Kolben, in einem Endvolumen von 10 ml-20% EMEM + S, Säen von 1 bis 5 × 10 6 Zellen / Kolben. Mit 8 ml erwärmt Trypsin pro T-75 cm 2-Kolben, um Zellen, Subkultur von einem T-75 cm 2-Kolben lösen in 2 T-75 cm 2-Kolben. Für ein optimales Zellwachstum, nicht Subkultur Zellen in Kolben größer als T-75 cm 2 oder Subkultur in einem Verhältnis größer als 1 übergeordneten Kolben: 3 neue Flaschen. Sobald Zellen wurden subkultiviert, vollständig zu entfernen und zu ersetzen Medium alle 2 bis 3 Tage, bis sie 75-90% Konfluenz erreichen. Zellen können bis zu 3 Wochen zu 75-90% Konfluenz erreichen. Für eine optimale Erzeugung polarisierten Kulturen, Subkulturen Zellen, bevor sie wachsen über 90% Konfluenz als Monolayer. Weiterhin Subkultur Zellen, bis genügend Zellen auf Saatgut der gewünschten Anzahl von Einsätzen Transwell gewachsen sein. Jeder Transwell-Einsatz benötigt 2 × 10 5 Zellen. Für eine optimale Leistung Erzeugen polarisierten Kulturen, Zellen verwenden, die nicht mehr als 10 Subkulturen unterzogen wurden. 2. Wachsende Polarized Calu-3 Liquid-bedeckten Kulturen (LCC) Sicherheitshinweise: Führen Sie alle in einer biologischen Sicherheitswerkbank mit sterilen Kultur Technik. Planen EMEM mit 10% FBS (EMEM-10%) und warm in einem Wasserbad auf 37 ° C. Bereiten Sie eine 24-Well-Transwell Platte für die Aussaat. Mit einer sterilen Pinzette bewegen Transwell Einsätze aus dem Inneren zum Äußeren Reihen der Platte ohne den Einsatz Membran. Zellen sollten nur in die Vertiefungen auf den äußeren Reihen der Platte subkultiviert werden. Um die Einführung der Luftblasen in die basolateralen Kompartimenten verhindern, fügen 600 ul EMEM-10% zu jedem durch Abwinkeln der Pipette gegen die Wand jedes Abteil und langsam freisetzenden das Medium in das Bohrloch. Nehmen Zellen aus T-75 cm 2 Gewebe. Subculture Flaschen mit warmen Trypsin, waschen und in 30 ml EMEM-20% + S pro alle 2 Flaschen des trypsinierten Zellen, wie in Schritt 1.2 beschrieben. Gründlich resuspendieren gewaschenen Zellen in 5 ml EMEM-10% durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren. Nachweis lebensfähiger und insgesamt Zellzahlen von der Trypanblau-Methode. Fahren Sie nur fort, wenn 80% – 90% lebensfähig sind. In einem 50 ml konischen Röhrchen sterile, verdünnte Zellen auf eine Konzentration von 2 × 10 6 lebensfähigen Zellen / ml mit 10% EMEM-. Hinzufügen von Zellen auf der apikalen Kammer jeder Transwell. Um Vertiefungen A1 und D1, die zellfreie Kontrollvertiefungen, dass Rohlinge ist, fügen Sie 100 ul EMEM-10% ohne Zellen sein wird. Zu jedem der verbleibenden Vertiefungen werden 100 ul resuspendierten Calu-3-Zellen, die Pipette vorsichtig Angelgewässer gegen die innere Führungskanal der Einsatzwand und langsam freisetzende die Zellen. Berühren Sie nicht die Pipette mit dem Einsatz Membran. Um eine homogene Suspension von Calu-3-Zellen erhalten, die leicht bewegen Zellsuspensionwährend dieser Seeder Schritt. Inkubieren Transwell Platte bei 37 ° C und 7% CO 2 in Luft-Atmosphäre. Legen Sie die Platte in einem Brutschrank, wo physische Störungen minimal sein wird. Um die Effizienz der Polarisation zu verbessern, nicht stapeln Platten auf der jeweils anderen. Um Kulturen zu halten, bis polarisiert und bereit, in den Experimenten zu verwenden, vollständig ersetzen Medium in Transwells, wie in den Schritten 2,10 bis 2,13 beschrieben. Medium sollte vollständig drei Tage nach sie in Transwells subkultiviert ersetzt werden, und dann auf einem alternierenden Zyklus zwischen dem vierten und dann dritten Tag nach der letzten Fütterung, bis die Zellen vollständig polarisiert sind. Warm EMEM-10% in einem Wasserbad auf 37 ° C. Vorsichtig absaugen Medium von Transwell-Einsätze. Mit einem Kapillarpipette an einer Vakuumfalle mit einem leichten Vakuum, oder mit einem Standard 1 ml Pipette Aspirat Mediums aus zellfreien Vertiefungen A1 und D1, dann von Vertiefungen ausgesät, zunächst Entfernen apikalen Mediums von allen Vertiefungen und then Entfernen basolateralen Medium aus allen Wells. Berühren Sie nicht einfügen Membranen während Absaugen Medium. Hinzufügen 200 ul EMEM-10% auf die apikale Kompartiment von zellfreien Vertiefungen A1 und D1, dann in die Vertiefungen ausgesät, Leiten des Mediums in die apikale Kompartiment mit der Seite des Einsatzes, um die Pipettenspitze zu führen. Fügen Sie nicht Mediums direkt auf Zellen, und berühren Sie nicht die Einlage Membran. Fügen Sie 600 ul EMEM-10% auf den basolateralen Kompartimenten. Um die Einführung der Luftblasen in die basolateralen Kompartimenten verhindern, fügen Mediums zu jedem durch Abwinkeln der Pipette gegen die Wand jedes Abteil und langsam freisetzenden das Medium in das Bohrloch. 3. Auswertung Resistance Entwicklung von Calu-3 LCC Sicherheitshinweise: Führen Sie alle in einer biologischen Sicherheitswerkbank mit sterilen Kultur Technik. Bewerten transepithelialen elektrischen Widerstandes (TEER) von Calu-3 LCC 30 min nachMedium ändert; die Auswertung nach jedem Mediumwechsel durchgeführt werden können, falls gewünscht. Führen Sie Messungen unter sterilen Bedingungen. Beginnen Messungen mit der zellfreie Kontrollvertiefungen A1 und D1 (die Zuschnitte) an Baseline-Messungen zu erhalten, und weiterhin mit Messungen für jede Vertiefung. Unter sterilen Bedingungen übertragen die STX2 Elektrode auf eine 50 ml Zentrifugenröhrchen mit 70% Ethanol in sterilem Wasser und 15 min sterilisiert. Kalibrieren und testen Sie die voltohmmeter für die Verwendung gemäß den Anweisungen des Herstellers. Nehmen Sie die Elektrode aus dem Ethanol, an der Luft trocknen 5-10 sec, und spülen Sie die Elektrode mit sterilen EMEM-10%. Stellen Sie den Modus-Schalter des voltohmmeter, um den Widerstand Einstellung, und schalten Sie ON. Sanft die Elektrode in einer der drei Anschlüsse, die Zugriff zu erlauben in die basolaterale Kompartiment einer Transwell Kultur. Die Elektrodenspitze so dass der längere Vorsprung nur leicht berührt den Boden der äußeren Wanne und bleibt vertikal,und die kürzere Blei im Gewebekulturmedium der apikalen Kammer, ohne den Einsatz Membran. Drücken Sie "Measure R"-Taste, und warten Sie für das Lesen zu stabilisieren. Wiederholen für die anderen zwei Ports für jede Vertiefung und Aufzeichnen der Messungen von allen drei Anschlüssen, also insgesamt aus drei Messungen pro Vertiefung. Weiter, um den Widerstand für alle Vertiefungen der Zellen zu messen. Die Elektrode durch Tränken 5 bis 10 min in 70% Ethanol, Spülen in sterilem dH 2 O und Trocknen gründlich. In der Originalverpackung aufbewahren. Berechnen des Widerstands jedes Wells, unter Verwendung von Gleichung 1. Ω Ist = Ω Probe – Ω blank, Gleichung 1 wo Ω Probe ist die durchschnittliche Messung von einem seeded gut und Ω blank ist die durchschnittliche Messung von der 2 Brunnen, A1 und D1, die Einsätze und mittlere, aber keine Zellen. Berechnen Sie die Flächeneinheit Widerstand, mit Equation 2. Ω tatsächlichen × effektiven Membranfläche = Ω × cm 2, Gleichung 2 wo die effektive Membranfläche beträgt 0,33 cm 2 für 24-Well-Transwell-Einsätze. Überprüfen, ob Polarisation ist durch Durchführen einer sekundären Assay vollständig, Messen Natriumfluorescein passive Diffusion zwischen den apikalen und basolateralen Kompartimenten, auf ein bis drei Transwell Kulturen. Die Vertiefungen für den Assay verwendet Natriumfluorescein ist unmittelbar nach Beendigung des Tests zu verwerfen. Planen nicht fluoreszierenden Puffer (118 mM NaCl; 4,75 mM KCl; 2,53 mM CaCl 2 · 2H 2 O; 2,44 mM MgSO4; 1,19 mM KH 2 PO 4, 25 mM NaHCO 3 in sterilem Wasser; Sterilfilter mit 0,45 um Filtrationsvorrichtung ). Bereiten Natriumfluorescein bei 1 mg / ml in nicht-fluoreszierenden Puffer, Sterilfilter, in Alufolie wickeln und bei 4 ° C, vor Licht geschützt. Warm, um Raum-temperaturre vor der Verwendung. Nach Abschluss Widerstandsmessungen, vorsichtig Mediums aus beiden basolateralen und apikale Kammern von einem bis drei einzelnen Transwell Kulturen. Spülen Transwell Kulturen. Sanft hinzuzufügen 600 ul sterilem Raumtemperatur Dulbeccos PBS (D-PBS) in die basolateralen Kompartimenten und 100 ul sterilem Raumtemperatur D-PBS zu den apikalen Kompartimenten. Entfernen Sie vorsichtig D-PBS aus Brunnen. Fügen Sie 600 ul sterilem nicht-fluoreszierenden Puffer zu den basolateralen Kompartimenten. Fügen Sie 100 ul sterilem 1 mg / ml Natrium-Fluorescein an die apikalen Fächern. Inkubieren der Platte bei 37 ° C für 1 Stunde. CO 2 ist während dieser Inkubationszeit erforderlich. Während der Inkubation, bereiten Sie einen Natriumfluorescein Standardkurve zwischen 20 pg / ml und 0 pg / ml, mit nicht-fluoreszierenden Puffer Natriumfluorescein verdünnen. Planen mindestens 8 verschiedenen Konzentrationen von Natriumfluorescein, die jeweils in einem Endvolumen von mindestens 600 ul. HaltenStandardkurve Verdünnungen von leichten bis zu seiner Absorption messen geschützt. Übertragen der nicht-fluoreszierenden Probe aus dem Puffer basolaterale Kompartiment jedes Tests zu einem separaten Transwell sauberes Röhrchen für die Analyse. Nehmen Sie den Test Transwells verwendet, um passive Natriumfluorescein Diffusion aus der Platte zu prüfen und zu verwerfen. Bringen Sie die Platte mit den restlichen Transwells in den Inkubator. Zeigen 100 ul jeder Standardlösung in dreifacher Ausfertigung in eine 96-Well-Flachboden-Platte. Bereiten Sie drei Verdünnungen von jedem basolateralen Probe (1:2, 1:20 und 1:50) in nicht-fluoreszierenden Puffer und 100 ul jeder unverdünnten Probe und jeder Verdünnung, in zweifacher Ausfertigung, in eine 96-Well-Flachbild- Bodenplatte. Maßnahme Probenabsorption auf einem ELISA-Plattenlesegerät bei 486 nm oder 490 nm beträgt. Bestimmung der Konzentration von Natrium-Fluorescein im basolaterale Kompartiment durch Vergleich der Absorption der Proben gegen die Absorptionswerte für die Natriumfluorescein strAndard Kurve. 4. Infizieren Polarized Calu-3 LCC mit Respiratory Virus Sicherheitshinweise: Führen Sie alle in einer biologischen Sicherheitswerkbank mit sterilen Kultur-Technik, einer Sicherheitsstufe geeignet für das Virus verwendet wird. Verdünnte Virus in serumfreiem EMEM so daß gewünschte Inocula in 100 ul wäre. Waschen der Zellen in serumfreiem EMEM. Vorsichtig absaugen Medium aus allen Vertiefungen, die Beseitigung der apikalen Medium dann den basolateralen Medium. Mit einem Kapillarpipette an einer Vakuumfalle mit einem leichten Vakuum, oder mit einem Standard 1 ml Pipette Aspirat Mediums aus zellfreien Vertiefungen A1 und D1, dann von Vertiefungen ausgesät, das Entfernen des ersten apikalen Mediums von allen Vertiefungen, und dann Entfernen der basolateralen Medium aus allen Wells. Berühren Sie nicht einfügen Membranen während Absaugen Medium. Je 100 ul serumfreiem EMEM zum apikalen Abteil zellfreie Vertiefungen A1 und D1 und dann zu ter Vertiefungen ausgesät, Leiten Mediums in die apikale Kompartiment mit der Seite des Einsatzes, um die Pipettenspitze zu führen. Fügen Sie nicht Medium direkt auf Zellen, und berühren Sie nicht die Einlage Membran. Hinzufügen 600 ul serumfreiem EMEM der basolateralen Kompartimenten. Hinzufügen zu jedem Medium Transwell durch Abwinkeln der Pipette gegen die Wand der Kammer und das langsam freisetzende Mittel in das Bohrloch. Vorsichtig absaugen serum-freiem Medium aus Brunnen. Beginnend mit infizierten oder Mock-infizierte Brunnen, fügen Sie entsprechende Virus-Verdünnungen zur apikalen Kompartiment Transwells. Für nicht infizierten Vertiefungen werden 100 ul serumfreiem EMEM zum apikalen Kammer geeigneter Transwells zum Schein infiziert Vertiefungen werden 100 ul virusfreie Präparation in serumfreiem EMEM zum apikalen Kammer geeigneter Transwells verdünnt und für Virusinfektion, verdünnter Virus in serumfreiem EMEM und 100 ul der apikale Kammern geeigneter Transwells. Fügen Sie 600 ul serumfreiem EMEM allen basolateralen Kompartimenten. Bei 37 ° C und 7% CO 2 für 2 Stunden. Absaugen Medium aus Brunnen, zuerst von infizierten und Mock-infizierte Brunnen, dann von infizierten Brunnen. Entfernen apikalen Überstände erstens durch basolateralen Überstände gefolgt. Ersetzen Medium mit 200 ul EMEM-10% in den apikalen Fächern und 600 ul EMEM-10% in den basolateralen Kompartimenten.