El establecimiento de un cultivo líquido cubierto de las vías respiratorias humanas epiteliales polarizadas Calu-3 células para estudiar la respuesta del huésped celular a patógenos respiratorios<em> In vitro</em

1. Cultivo de células Calu-3 para el uso en las culturas Transwell Medidas de seguridad: Realice todos los procedimientos en un gabinete de bioseguridad mediante la técnica de cultivo estéril. Para descongelar las células de almacenamiento de congelados: Preparar medio esencial mínimo de Eagle que contiene 20% inactivado por calor suero fetal bovino (FBS), 0,1 mM no aminoácidos esenciales, 2 mM L-glutamina, y 10 mM de HEPES, pH 7,4 (EMEM-20% + S). -Filtro estéril el medio preparado usando un 0,2 micras de tamaño de poro del filtro, y caliente en un baño de agua a 37 ° C. Para ser más reflexiva del entorno in situ en el epitelio de las vías respiratorias, medio no está suplementado con antibióticos o antimicóticos. Descongelar un criovial congelado de Calu-3 células rápidamente (<1 min) en un baño de agua a 37 ° C. Transfiera las células descongeladas a un tubo cónico de 50 ml estéril y añadir 30 ml de EMEM-20 calentado% + S. Sedimentar las células por centrifugación durante 5 min a 1,000-1,200 × g,sin refrigeración, y con la velocidad de frenado bajo. Decantar suavemente el sobrenadante y resuspender las células en 5 ml de EMEM caliente-20% + S pipeteando suavemente arriba y abajo. Semilla 2 a 5 x 10 6 células por pocillo en una placa de cultivo tisular de 6 pocillos y se incuba a 37 ° C, 7% de CO 2 en la atmósfera de aire hasta que las células son 75% – 80% confluente. Revise diariamente, hasta 7 días que sean necesarios. Cada 3-4 días aspirar el medio de las células y reemplazar con agua fresca EMEM-20% + S. Para las células subcultura: Tripsina 0,05% tibia – 0,02% de EDTA en un baño de agua a 37 ° C. Aspirar el medio de las células, y lavar las células una vez con tripsina calentada 0,05% – 0,02% de EDTA para eliminar el exceso de medio y suero. Eliminar el lavado y añadir 1 ml de tripsina calentado por pocillo a las células. Incubar a 37 ° C y 7% de CO 2 y el monitor bajo un microscopio cada 5 minutos hasta al menos 75% de células se separen del pozo (s) de la placa de cultivo de tejidos. Esto puedetomar entre 5 y 30 min. Lavar las células en EMEM-20% + S para eliminar el exceso de tripsina. Transferir las células tratadas con tripsina a un tubo cónico de 50 ml estéril. Varios pocillos de las células de una placa de cultivo de 6 pocillos se pueden mezclar en un tubo cónico de 50 ml estéril. Añadir 30 ml de EMEM-20% + S y sedimentar las células por centrifugación a 1,000-1,200 × g, sin necesidad de refrigeración, y con velocidad baja de freno. Decantar suavemente el sobrenadante y resuspender las células en EMEM fresco-20% + S pipeteando suavemente arriba y abajo. El uso de pasos a través de 1.2.1 1.2.3 arriba para Tripsinizar las células, las células continúan subcultivo en placas de cultivo de tejido como se describe en los pasos a través de 1.2.5 1.2.7 cuando están entre 75 – 80% confluente. Subcultivo de un pocillo de una placa de 6-y hasta un T-25 cm 2 matraz en un volumen final de 5 ml de EMEM-20% + S, sembrando entre 0,5 a 1 x 10 6 células / matraz. Uso de 5 ml de tripsina calentado por T-25 cm 2 matraz para separar las células, subcultivode un T-25 cm 2 matraz hasta un T-75 cm 2 matraz en un volumen final de 10 ml de EMEM-20% + S, sembrando entre 1 a 5 x 10 6 células / matraz. Con 8 ml de tripsina calentado por T-75 cm 2 frasco para desprender las células, subcultura de un T-75 cm 2 frasco en 2 T-75 cm 2 frascos. Para el crecimiento celular óptimo, no células de subcultivo en matraces mayores de T-75 cm 2 o subcultivo en una proporción mayor que matraz de matriz 1: 3 frascos nuevos. Una vez que las células han sido subcultivadas, completamente quitar y reemplazar medio cada 2 a 3 días hasta que alcanzan 75-90% de confluencia. Las células pueden tomar hasta 3 semanas para llegar a 75-90% confluencia. Para la generación óptima de las culturas polarizadas, células subcultura antes de que crezcan más allá del 90% de confluencia en forma de monocapa. Continuar con las células de subcultivo hasta que las células han crecido suficientes para sembrar el número deseado de inserciones Transwell. Cada inserto Transwell requiere 2 × 10 5 células. Para obtener un rendimiento óptimo de la generación de cultivos polarizados, utilizar células que han sufrido no más de 10 subcultivos. 2. Crecimiento polarizadas Calu-3 líquido cubiertas Culturas (LCC) Medidas de seguridad: Realice todos los procedimientos en un gabinete de bioseguridad mediante la técnica de cultivo estéril. Preparar EMEM que contenía FBS al 10% (EMEM-10%) y se calienta en un baño de agua a 37 ° C. Preparar una placa de 24 pocillos Transwell para la siembra. Utilizando pinzas estériles, inserciones Transwell de mover desde el interior de las filas exteriores de la placa sin tocar la membrana de inserción. Las células sólo se debe subcultivar en pocillos en las filas exteriores de la placa. Para evitar la introducción de burbujas de aire en los compartimentos basolaterales, añadir 600 l de EMEM-10% a cada uno inclinando la pipeta contra la pared de cada compartimento y liberar lentamente el medio en el pozo. Separar las células de T-75 cm 2 de tejido. Subculture matraces usando tripsina calentado, y lavar con 30 ml de EMEM-20% + S por cada 2 frascos de células tratadas con tripsina, como se describe en el paso 1,2. A fondo resuspender las células lavadas en 5 ml de EMEM-10% pipeteando suavemente arriba y abajo. Determinar el recuento de células viables y totales por el método de exclusión con azul de tripano. Procede sólo si 80% – 90% son viables. En un tubo cónico de 50 ml estéril, diluir las células a una concentración de 2 x 10 6 células viables / ml con EMEM-10%. Añadir las células en el compartimiento apical de cada Transwell. A los pocillos A1 y D1, que será libres de células pocillos de control, es decir, espacios en blanco, añadir 100 ml de EMEM-10% sin células. Para cada uno de los pocillos restantes, añadir 100 ml de resuspensión de Calu-3 células, inclinando suavemente la pipeta contra el canal de guía interior de la pared del inserto y liberando lentamente las células. No toque la pipeta a la membrana de inserción. Para mantener una suspensión homogénea de Calu-3 células, agitar suavemente la suspensión celulardurante esta etapa de siembra. Incubar la placa Transwell a 37 º C y 7% de CO 2 en atmósfera de aire. Colocar la placa en una incubadora donde perturbación física será mínimo. Para mejorar la eficiencia de la polarización, no se apilan las placas en la parte superior de la otra. Para mantener los cultivos hasta polarizada y listo para usar en los experimentos, reemplazar completamente medio en transwells, como se describe en los pasos a través de 2,10 2,13 continuación. Medio debe ser reemplazado por completo tres días después de que se subcultivan en transwells, y luego en un ciclo de alternancia entre el día cuarto y tercero continuación, después de la alimentación anterior, hasta que las células son completamente polarizada. Warm EMEM-10% en un baño de agua a 37 ° C. Suavemente aspirar medio de inserciones Transwell. Con una pipeta capilar conectado a una trampa de vacío con un vacío suave, o con un estándar de pipeta de 1 ml, medio aspirado de células libres de los pocillos A1 y D1, a continuación, a partir de semillas pozos, primero la eliminación de medio apical de todos los pocillos, y tla eliminación de gallina medio basolateral de todos los pocillos. No toque las membranas de inserción mientras se aspira medio. Añadir 200 l de EMEM-10% para el compartimento apical de células libres de los pocillos A1 y D1, a continuación, a los pocillos sembrados, dirigir el medio en el compartimiento apical con el lateral de la pieza de inserción para guiar la punta de la pipeta. No agregue medio directamente en las células, y no toque la membrana de inserción. Añadir 600 l de EMEM-10% de los compartimentos basolaterales. Para evitar la introducción de burbujas de aire en los compartimentos basolaterales, se añade medio a cada uno inclinando la pipeta contra la pared de cada compartimento y liberar lentamente el medio en el pozo. 3. Evaluación del Desarrollo de la Resistencia de Calu-3 LCC Medidas de seguridad: Realice todos los procedimientos en un gabinete de bioseguridad mediante la técnica de cultivo estéril. Evaluar trans-epitelial resistencia eléctrica (TEER) de Calu-3 LCC 30 min después decambios de medio; la evaluación se puede realizar después de cada cambio de medio, si se desea. Realizar mediciones bajo condiciones estériles. Comenzar las mediciones con pozos el control libre de células A1 y D1 (los espacios en blanco) para obtener mediciones de referencia, y continuar con las mediciones para cada pocillo. En condiciones estériles, transferir el electrodo stx2 a un tubo de centrífuga de 50 ml que contiene 70% de etanol en agua estéril, y esterilizar 15 min. Calibrar y probar el voltohmmeter para uso de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Retire el electrodo del etanol, el aire seco 5-10 segundos, y enjuague el electrodo con agua estéril EMEM-10%. Ajuste el selector de modo de la voltohmmeter al ajuste de resistencia y encender el equipo. Suavemente coloque el electrodo en uno de los 3 puertos que permiten el acceso al compartimiento basolateral de una cultura Transwell. Coloque el electrodo para que la iniciativa es sólo toque ligeramente el fondo del pozo externo y se mantiene vertical,y el cable más corto es en el medio de cultivo tisular del compartimiento apical, sin tocar la membrana de inserción. Empuje "Medida R" botón, y esperar a que la lectura se estabilice. Repetir para los otros 2 puertos para cada pocillo y registrar las mediciones de los tres puertos, para un total de tres mediciones por pocillo. Continuar para medir la resistencia de todos los pocillos de células. Limpiar el electrodo por remojo 5-10 min en 70% de etanol, lavado en dH 2 O estéril, y secado a fondo. Conservar en el envase original. Calcular la resistencia de cada pocillo, utilizando la Ecuación 1. Ω = Ω real de la muestra – Ω en blanco, la ecuación 1 donde la muestra Ω es la medida media de un pozo sin semillas y en blanco Ω es la medida promedio de los 2 pozos, A1 y ​​D1, que contiene las inserciones y medianas, pero las células no. Calcular la resistencia unidad de área, utilizando Equación 2. Ω real x = área efectiva de la membrana × Ω cm 2, la ecuación 2 donde el área efectiva de la membrana es 0,33 cm 2 para 24-así inserciones Transwell. Compruebe que la polarización se completa mediante la realización de un ensayo secundario, la medición de la difusión pasiva de fluoresceína de sodio entre los compartimentos apical y basolateral, de una a tres cultivos Transwell. Los pozos utilizados para el ensayo de fluoresceína sódica deben ser desechados inmediatamente después de la finalización del ensayo. Prepare no fluorescente tampón (118 mM NaCl, 4,75 mM KCl, 2,53 mM CaCl 2 .2 H 2 O; 2,44 mM MgSO 4, 1,19 mM KH 2 PO 4, 25 mM NaHCO 3 en agua estéril; filtro estéril con 0,45 micras dispositivo de filtración ). Preparar fluoresceína de sodio a 1 mg / ml en tampón no fluorescente, filtro estéril, envolver en papel de aluminio, y se almacenan a 4 ° C, protegido de la luz. Calentar a habitación temvolver antes de su uso. Después de completar las mediciones de resistencia, retirar cuidadosamente medio de los compartimentos apical y basolateral de uno a tres cultivos individuales Transwell. Enjuague culturas Transwell. Suavemente añadir 600 l a temperatura ambiente estéril PBS de Dulbecco (D-PBS) a los compartimentos basolaterales y 100 l a temperatura ambiente estériles D-PBS a los compartimentos apical. Retire con cuidado D-PBS de los pozos. Añadir 600 l estéril no fluorescente tampón a los compartimentos basolaterales. Añadir 100 l estéril de 1 mg / ml de fluoresceína de sodio a los compartimentos apical. Incubar la placa a 37 ° C durante 1 hr. CO 2 no es necesario durante esta incubación. Durante la incubación, preparar una curva estándar de fluoresceína sódica que oscila entre 20 mg / ml y 0 g / ml, utilizando no fluorescente tampón para diluir la fluoresceína sódica. Preparar al menos 8 diferentes concentraciones de fluoresceína de sodio, cada uno en un volumen final de al menos 600 l. Mantenerdiluciones de la curva estándar protegido de la luz hasta el momento de medir la absorbancia. Transferir la muestra tampón no fluorescente desde el compartimento basolateral de cada Transwell de prueba a un tubo limpio separado para el análisis. Eliminar la prueba transwells utilizado para examinar la difusión pasiva de fluoresceína de sodio de la placa y desechar. Devolver la placa con transwells restantes a la incubadora. Coloque 100 l de cada solución estándar por triplicado en un 96-pocillos de fondo plano placa. Preparar tres diluciones de cada muestra basolateral (1:2, 1:20, y 1:50) en tampón no fluorescente, y añadir 100 ml de cada muestra no diluida y de cada dilución, en duplicado, en un 96-bien plana placa de fondo. Medir la absorbancia de la muestra en un lector de placas de ELISA a 486 nm o 490 nm. Determinar la concentración de fluoresceína de sodio en el compartimento basolateral mediante la comparación de la absorbancia de las muestras en contra de los valores de absorbancia de la fluoresceína sódica stAndard curva. 4. Infección Polarized Calu-3 LCC con virus respiratorio Medidas de seguridad: Realizar todos los procedimientos en un gabinete de seguridad biológica usando técnica de cultivo estéril, a un nivel de bioseguridad adecuado para el virus que se utiliza. Diluir virus en EMEM libre de suero de modo que los inóculos deseado sería en 100 l. Lavar las células en EMEM libre de suero. Suavemente aspirar medio de todos los pocillos, eliminando el medio apical luego el medio basolateral. Con una pipeta capilar conectado a una trampa de vacío con un vacío suave, o con un estándar de pipeta de 1 ml, medio aspirado de células libres de los pocillos A1 y D1, a continuación, a partir de semillas pozos, primero eliminando el medio apical de todos los pocillos, y después eliminando el medio basolateral de todos los pocillos. No toque las membranas de inserción mientras se aspira medio. Añadir 100 l de EMEM libre de suero para el compartimiento apical de células libres de los pocillos A1 y D1, y después a tél sin semillas pocillos, dirigiendo medio en el compartimiento apical con el lateral de la pieza de inserción para guiar la punta de la pipeta. No agregue medio directamente en las células, y no toque la membrana de inserción. Añadir 600 l de EMEM libre de suero a los compartimentos basolaterales. Añadir medio a cada Transwell inclinando la pipeta contra la pared del compartimento y liberar lentamente el medio en el pozo. Suavemente aspire el suero libre de medio de pozos. Empezando con los pozos no infectados o infectados mock-, añadir las diluciones adecuadas de virus para el compartimento apical de transwells. Para los pozos no infectados, añadir 100 ml de EMEM libre de suero para el compartimento apical de transwells apropiados, por infección simulada pocillos, añadir 100 l de virus libre de la preparación diluida en EMEM libre de suero para el compartimento apical de transwells adecuadas, y por infección por virus, virus diluir en EMEM libre de suero y añadir 100 ml de los compartimentos apical de transwells apropiadas. Añadir 600 l de EMEM libre de suero para todos los compartimentos basolaterales. Incubar a 37 ° C y 7% de CO 2 durante 2 horas. Aspirar el medio de pozos, en primer lugar de los pozos infectados y no infectados por el simulacro, luego de los pozos infectados. Eliminar los sobrenadantes apicales primero, seguidos por los sobrenadantes basolateral. Reemplazar medio con 200 l de EMEM-10% en los compartimentos apical y 600 l de EMEM-10% en los compartimentos basolaterales.