Tot oprichting van een Liquid bedekte cultuur van gepolariseerde menselijke luchtwegen Epiteel Calu-3 cellen aan Host Cell Reactie op respiratoire pathogenen Studie<em> In vitro</em

1. Kweken Calu-3 cellen voor gebruik in Transwell Cultures Veiligheidsmaatregelen: Voer alle procedures in een bioveiligheid kast met steriele cultuur techniek. Om cellen van bevroren opslag ontdooien: Bereid Minimum Essential Eagle's medium dat 20% hitte-geïnactiveerd foetaal bovine serum (FBS), 0,1 mM niet-essentiële aminozuren, 2 mM L-glutamine, en 10 mM HEPES pH 7,4 (EMEM-20% + S). Steriel filter het bereide medium met een 0,2 urn poriegrootte filter en warm in een waterbad tot 37 ° C. Om meer een afspiegeling is van de in situ luchtwegepitheel omgeving, is medium niet aangevuld met antibiotica of antimycotica. Ontdooi een bevroren Cryovial van Calu-3 cellen snel (<1 min) in een 37 ° C waterbad. Breng de ontdooide cellen naar een steriele 50 ml conische buis en voeg 30 ml verwarmd EMEM-20% + S. Pelleteren van de cellen door centrifugatie gedurende 5 minuten bij 1,000-1,200 xg,zonder koeling, en met een lage rem snelheid. Giet het supernatant voorzichtig en suspendeer de cellen in 5 ml EMEM-20 opgewarmde% + S voorzichtig op en neer pipetteren. Zaad 2 tot 5 x 10 6 cellen per putje in een 6-well weefselkweekplaat en incubeer bij 37 ° C, 7% CO2 in lucht atmosfeer tot de cellen 75% – 80% confluent. Controleer dagelijks, tot 7 dagen kan noodzakelijk zijn. 3-4 dagen aspireer het medium van de cellen en vervangen door vers EMEM-20% + S. Om subcultuur cellen: Warm 0,05% trypsine – 0,02% EDTA in een 37 ° C waterbad. Zuig het medium van de cellen en eenmaal wassen cellen met verwarmde 0,05% trypsine – 0,02% EDTA om overtollig medium en serum te verwijderen. Verwijder het wassen en voeg 1 ml verwarmd trypsine per putje om de cellen. Incubeer bij 37 ° C en 7% CO2 en monitor onder een microscoop om de 5 min tot ten minste 75% van de cellen los van de put (s) van de weefselkweekplaat. Dit kaner 5 tot 30 minuten. Was de cellen in EMEM-20% + S om overmaat trypsine te verwijderen. Breng de getrypsiniseerde cellen in een 50 ml steriele conische buis. Meerdere putjes cellen van een 6-well kweekplaat worden samengevoegd in een 50 ml steriele conische buis. Voeg 30 ml EMEM-20% + S en de pellet cellen door centrifugatie bij 1,000-1,200 xg, zonder koeling, en met lage snelheid remmen. Voorzichtig Giet het supernatant en resuspendeer de cellen in vers EMEM-20% + S voorzichtig op en neer pipetteren. Met behulp van de stappen 1.2.1 tot 1.2.3 hierboven om de cellen trypsinize, om subcultuur cellen blijven in weefselkweekplaten zoals beschreven in de stappen 1.2.5 tot 1.2.7 als ze tussen de 75 – 80% confluent. Subcultuur van een putje van een 6-well plaat tot een T-25 cm2 fles in een eindvolume van 5 ml EMEM-20% + S, zaaien tussen 0,5 tot 1 x 10 6 cellen / kolf. Met 5 ml trypsine verwarmd per T-25 cm2 kolf cellen los subcultuurvan een T-25 cm2 fles tot een T-75 cm2 fles in een eindvolume van 10 ml EMEM-20% + S, zaaien van 1 tot 5 x 10 6 cellen / kolf. Met 8 ml trypsine verwarmd per T-75 cm2 fles voor cellen subcultuur losmaken van een T-75 cm2 fles in 2 T-75 cm2 flessen. Voor optimale celgroei, niet subcultuur cellen in kolven groter dan 75 cm T-2 of subcultuur in een verhouding groter dan 1 parent kolf: 3 nieuwe flessen. Zodra cellen zijn gekweekt, volledig verwijderen en vervangen medium om de 2 tot 3 dagen totdat ze 75-90% confluentie. Cellen kan tot 3 weken 75-90% confluentie bereiken. Voor een optimale generatie van gepolariseerde culturen, subcultuur cellen voordat ze groeien dan 90% confluentie als een monolaag. Blijf subcultuur cellen totdat er genoeg cellen zijn uitgegroeid tot zaad het gewenste aantal Transwell inserts. Elke Transwell insert is 2 x 10 5 cellen. Voor optimale prestaties genereren gepolariseerde culturen gebruiken cellen die ondergaan niet meer dan 10 subculturen. 2. Groeiende Gepolariseerde Calu-3 Liquid bedekte culturen (LCC) Veiligheidsmaatregelen: Voer alle procedures in een bioveiligheid kast met steriele cultuur techniek. Bereid EMEM met 10% FBS (EMEM-10%) en warm in een waterbad tot 37 ° C. Bereid een 24-well Transwell plaat voor het zaaien. Met behulp van een steriel pincet, bewegen Transwell inserts van de binnenkant naar de buitenkant rijen van de plaat zonder het aanraken van de insert membraan. Cellen moeten alleen gekweekt in putten op de buitenkant van de plaat rijen. De invoering van luchtbellen te voorkomen in de basolaterale compartimenten, voeg 600 ul van EMEM-10% aan elk van de hoek van de pipet tegen de wand van elk compartiment en langzaam los het medium in de put. Los cellen van T-75 cm2 weefselkweek. Subculture kolven met trypsine verwarmd, en was in 30 ml EMEM-20% + S per elke 2 kolven van trypsine cellen, zoals beschreven in stap 1.2. Grondig gewassen resuspendeer de cellen in 5 ml EMEM-10% door het voorzichtig op en neer pipetteren. Bepaal levensvatbare en de totale celtellingen door de trypan blauw uitsluiting methode. Ga alleen als 80% – 90% zijn haalbaar. In een 50 ml steriele conische buis, verdun celconcentratie van 2 x 10 6 levensvatbare cellen / ml met EMEM-10%. Voeg cellen aan het apicale compartiment van elk Transwell. De putjes A1 en D1, die zal worden celvrije controleputjes, dat, blanco, 100 ul EMEM-10% toe zonder cellen. Aan elk van de resterende putjes, 100 ul geresuspendeerde Calu-3 cellen voorzichtig de hoek van de pipet tegen de binnenzijde geleidingskanaal van de insert wand en langzaam loslaten van de cellen. Gebruik de pipet niet in aanraking met de insert membraan. Om een ​​homogene suspensie van Calu-3 bloedcellen voorzichtig schudden de celsuspensietijdens deze stap zaaien. Incubate Transwell plaat bij 37 ° C en 7% CO2 in lucht atmosfeer. Leg de plaat in een incubator waar fysieke verstoring minimaal zal zijn. Om de efficiëntie van polarisatie verbeteren, niet stapelen platen op elkaar. Om kweken te handhaven totdat gepolariseerd en klaar voor gebruik in experimenten volledig vervangen medium in transwells, zoals beschreven in stap 2,10 tot 2,13 hieronder. Medium moet volledig vervangen worden drie dagen na subcultuur in transwells en een hertz tussen de vierde en derde dag na de vorige voeding tot cellen volledig gepolariseerd. Warm EMEM-10% in een waterbad tot 37 ° C. Zuig medium van Transwell inserts. Met een capillaire pipet met het vacuümsysteem trap met een zacht vacuüm, of een standaard 1 ml pipet, aspiraat medium van celvrije putjes A1 en D1, dan van seeded wells eerste verwijderen apicale medium van alle putjes en tkip verwijderen basolaterale medium uit alle putjes. Raak insert membranen tijdens het opzuigen medium. Voeg 200 ul EMEM-10% van de apicale compartiment van cel putjes A1 en D1, daarna de geënte putjes, leiden het medium in het apicale compartiment met de zijkant van het inzetstuk aan de pipetpunt leiden. Voeg geen medium direct op cellen, en raak het inzetstuk membraan. Voeg 600 ul van EMEM-10% van de basolaterale compartimenten. De invoering van luchtbellen te voorkomen in de basolaterale compartimenten toe medium aan elk van de hoek van de pipet tegen de wand van elk compartiment en langzaam los het medium in de put. 3. Het evalueren van resistentie-ontwikkeling van Calu-3 LCC Veiligheidsmaatregelen: Voer alle procedures in een bioveiligheid kast met steriele cultuur techniek. Evalueer trans-epitheliale elektrische weerstand (TEER) van Calu-3 LCC 30 min namedium veranderingen, de evaluatie kan worden uitgevoerd na elke medium verandering indien gewenst. Voer metingen onder steriele omstandigheden. Beginnen metingen met de celvrije controleputjes A1 en D1 (de blanco) tot nulmetingen verkrijgen, en verder met metingen voor elk putje. Onder steriele omstandigheden, overdragen stx2 elektrode een 50 ml centrifugebuis bevattende 70% ethanol in steriel water en 15 min steriliseren. Kalibreer en test de voltohmmeter voor gebruik volgens fabrikant. Verwijder de elektrode uit de ethanol, lucht drogen 5-10 sec, en spoel de elektrode met een steriele EMEM-10%. Zet de modusschakelaar van de voltohmmeter om de weerstand instelling en zet het apparaat in. Plaats voorzichtig de elektrode in een van de drie poorten die toegang te verlenen tot de basolaterale compartiment van een Transwell cultuur. Place elektrode zodat de lange draad slechts licht tegen de onderkant van de buitenste goed en de hoogte,en kortere doorlooptijd is in het weefselkweekmedium van het apicale compartiment, zonder het inzetstuk membraan. Druk op "Measure R" knop en wacht tot de waarde stabiel is. Herhaal voor de andere twee poorten voor elk putje en noteer de metingen van alle drie poorten, voor een totaal van drie metingen per well. Blijf de weerstand te meten voor alle putten van cellen. Reinig de elektrode 5-10 min onderdompelen in 70% ethanol, spoelen in steriel dH 2 O en drogen goed. Bewaren in de oorspronkelijke verpakking. Bereken de weerstand van elk putje met behulp van vergelijking 1. Ω feitelijke = Ω monster – Ω blanco, Vergelijking 1 waar Ω monster de gemiddelde maat van een geënte goed en Ω blank de gemiddelde meting van de 2 putjes, A1 en D1, die inserties en medium, maar geen cellen. Bereken het eenheidgebied weerstand, met Equatie 2. Ω werkelijke × effectieve membraanoppervlak = Ω · cm 2, vergelijking 2 een effectief membraanoppervlak is 0,33 cm 2 voor 24-well Transwell inzetstukken. Controleer of polarisatie voltooid door het uitvoeren van een secundaire test, meten passieve natriumfluoresceïne diffusie tussen de apicale en basolaterale compartimenten, een tot drie Transwell culturen. De putjes voor de assay natriumfluoresceïne moet worden weggegooid onmiddellijk na voltooiing van de test. Bereid niet fluorescerende buffer (118 mM NaCl, 4,75 mM KCl, 2,53 mM CaCl2 .2 H 2 O; 2,44 mM MgSO4, 1,19 mM KH 2PO 4, 25 mM NaHCO 3 in steriel water, steriel filter met 0,45 urn filterinrichting ). Bereid natriumfluoresceïne bij 1 mg / ml in niet-fluorescerende buffer, steriel filter, wikkel in aluminiumfolie en bewaar bij 4 ° C, beschermd tegen licht. Warm om ruimte temperaopnieuw voor gebruik. Na het voltooien weerstandsmetingen, verwijder medium van zowel de basolaterale en apicale compartimenten van een tot drie afzonderlijke Transwell culturen. Spoel Transwell culturen. Zachtjesaan 600 pi kamertemperatuur steriele Dulbecco's PBS (D-PBS) aan de basolaterale compartimenten en 100 pi kamertemperatuur steriele D-PBS op de apicale compartimenten. Verwijder voorzichtig D-PBS uit putten. Voeg 600 pl steriele niet-fluorescerende buffer aan de basolaterale compartimenten. Voeg 100 ul steriel 1 mg / ml natriumfluoresceïne de apicale compartimenten. Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 1 uur. CO 2 is niet nodig tijdens deze incubatieperiode. Tijdens incubatie bereiden een natriumfluoresceïne standaardcurve variërend tussen 20 ug / ml en 0 ug / ml, met niet-fluorescerende buffer natriumfluoresceïne verdunnen. Bereid ten minste 8 verschillende concentraties natriumfluoresceïne, elk in een eindvolume van ten minste 600 pi. Houdenstandaardcurve verdunningen beschermd tegen licht tot klaar om absorptie te meten. Breng de niet fluorescerende buffer monster uit de basolaterale compartiment van elke test Transwell een andere schone buis voor analyse. Verwijder de test transwells gebruikt om een ​​passieve natriumfluoresceïne diffusie bestuderen van de plaat en gooi. Zet de plaat met de resterende transwells naar de incubator. Plaats 100 pl van elke standaardoplossing in drievoud in een 96-putjes met vlakke bodem plaat. Maak drie verdunningen van elk monster basolaterale (1:2, 1:20 en 1:50) in niet-fluorescerende buffer en voeg 100 ul van elk onverdund monster en van elke verdunning, in tweevoud, in een 96-well platte- bodemplaat. Proefstaal absorptie op een ELISA plaatlezer bij 486 nm of 490 nm. Het gehalte aan natriumfluoresceïne in de basolaterale compartiment door vergelijking van de absorptie van monsters tegen de absorptiewaarden voor de natriumfluoresceïne stAndard curve. 4. Infecteren Gepolariseerde Calu-3 LCC met respiratoire virus Veiligheidsmaatregelen: Voer alle procedures in een bioveiligheid kast met behulp van steriele cultuur-techniek, op een bioveiligheidsniveau geschikt is voor het virus wordt gebruikt. Verdun virus in serumvrij EMEM zodat de gewenste inocula zou in 100 ul. Was de cellen in serumvrij EMEM. Zuig medium van alle putjes, het verwijderen van de apicale medium dan de basolaterale medium. Met een capillaire pipet met het vacuümsysteem trap met een zacht vacuüm, of een standaard 1 ml pipet, aspiraat medium van celvrije putjes A1 en D1, dan van seeded wells, eerst het apicale medium van alle putjes, en vervolgens het verwijderen de basolaterale medium van alle putjes. Raak insert membranen tijdens het opzuigen medium. Voeg 100 ul serumvrij EMEM aan het apicale compartiment van cel putjes A1 en D1 en tHij geplaatste putten, leiden medium in het apicale compartiment met de zijkant van het inzetstuk aan de pipetpunt leiden. Voeg geen medium direct op cellen, en raak het inzetstuk membraan. Voeg 600 ul serumvrij EMEM de basolaterale compartimenten. Voeg medium om elke Transwell door hengelen de pipet tegen de wand van het compartiment en langzaam vrijgeven van het medium in de put. Zuig serumvrij medium uit de putjes. Beginnend met niet-geïnfecteerde of mock-geïnfecteerde putten, voeg de juiste virusverdunningen aan de apicale compartiment van transwells. Voor geïnfecteerde putjes, 100 ul serumvrij EMEM aan het apicale compartiment van geschikte transwells voor mock-geïnfecteerde putjes, 100 ul virusvrije preparaat verdund in serumvrij EMEM aan het apicale compartiment van geschikte transwells, en virusinfectie, verdund virus in serumvrij EMEM en voeg 100 ul aan de apicale compartimenten van geschikte transwells. Voeg 600 ul serumvrij EMEM alle basolaterale compartimenten. Incubeer bij 37 ° C en 7% CO2 gedurende 2 uur. Zuig medium uit putten, eerst van niet-geïnfecteerde en mock-geïnfecteerde putten, dan van geïnfecteerde putten. Verwijder apicale supernatanten eerst, gevolgd door basolaterale supernatanten. Vervangen medium met 200 ul EMEM-10% in de apicale compartimenten en 600 pi van EMEM-10% in het basolaterale compartimenten.