Создание жидкого покрытые культуры поляризованный человека эпителия дыхательных путей Calu-3 ячейки по изучению клетки-хозяина в ответ на возбудителей инфекций дыхательных путей<em> В пробирке</em

1. Культивирование Calu-3 Ячейки для использования в культурах Transwell Меры безопасности: Выполнить все процедуры в кабинете биологической безопасности с использованием стерильной техники культуры. Таять клеток из замороженной хранения: Подготовка минимальную поддерживающую среду Игла, содержащей 20% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), 0,1 мМ не-незаменимых аминокислот, 2 мМ L-глутамина, и10 мМ HEPES рН 7,4 (EMEM-20% + S). Стерильный фильтр подготовленной среде с помощью 0,2 мкм размеров пор фильтра, и теплая на водяной бане до 37 ° C. Чтобы быть более отражать на месте окружающую среду эпителия дыхательных путей, среднего не дополняется с помощью антибиотиков или противогрибковых. Оттепель замороженных криопробирку из Calu-3 клетки быстро (<1 мин) при 37 ° С водяной бане. Передача талой клеток в 50 мл стерильной коническую трубку и добавить 30 мл подогретого EMEM-20% + S. Осаждения клеток путем центрифугирования в течение 5 мин при 1000-1200 × г,без охлаждения, так и с низкой скоростью тормоза. Слейте супернатант осторожно и ресуспендирования клеток в 5 мл подогретого EMEM-20% + S, осторожно пипеткой вверх и вниз. Семенной 2 до 5 × 10 6 клеток на лунку в 6-луночный планшет для культивирования тканей и инкубировать при 37 ° C, 7% CO 2 в атмосфере воздуха до клетки 75% – 80% вырожденная. Проверьте ежедневно, до 7 дней может потребоваться. Каждые 3-4 дня аспирации среды от клеток и заменить его свежим EMEM-20% + S. Для субкультуры клеток: Теплый 0,05% трипсина – 0,02% ЭДТА при 37 ° C водяной бане. Аспирируйте среды из клеток, клетки и мыть один раз с подогретой 0,05% трипсина – 0,02% ЭДТА для удаления избытка среды и сыворотки. Снимите стирки и добавляют 1 мл нагревают трипсина на хорошо клеток. Инкубировать при 37 ° C и 7% CO 2 и монитор под микроскопом каждые 5 минут по крайней мере до 75% клетки отделяются от хорошо (ы) пластины культуре ткани. Это можетзанять от 5 до 30 мин. Вымойте клетки в EMEM-20% + S, чтобы удалить лишний трипсин. Передача трипсинизированных клеток в 50 мл стерильной коническую трубку. Несколько скважин клеток из одного 6-а культура пластины могут быть объединены в один 50 мл стерильной коническую трубку. Добавить 30 мл EMEM-20% + S и осаждения клеток центрифугированием при 1000-1200 × г, без охлаждения, так и с низкой скоростью тормоза. Слейте супернатант осторожно и ресуспендирования клеток в свежей EMEM-20% + S, осторожно пипеткой вверх и вниз. Использование шаги 1.2.1 через 1.2.3 выше trypsinize клетки, продолжают субкультуры клеток в культуре тканей блюда как описано в пунктах 1.2.5 через 1.2.7, когда они находятся в пределах от 75 – 80% вырожденная. Субкультура из одной ямы в 6-луночный планшет до одного Т-25 см 2 колбы в конечном объеме 5 мл EMEM-20% + S, посев от 0,5 до 1 × 10 6 клеток / колбу. Используя 5 мл нагревают трипсина на Т-25 см 2 колбы чтобы отделить клетки, субкультураот одного Т-25 см 2 колбы до одного Т-75 см 2 колбы в конечном объеме 10 мл EMEM-20% + S, посева от 1 до 5 × 10 6 клеток / колбу. Использование 8 мл нагревают трипсина на Т-75 см 2 колбы чтобы отделить клетки, субкультура от одного Т-75 см 2 колбы на 2 T-75 см 2 колбы. Для оптимального роста клеток, не субкультуру клеток в колбах больше, чем Т-75 см 2 или субкультуры в соотношении больше, чем 1 родитель колбы: 3 новых колб. Как только клетки были субкультивируют, полностью удалить и заменить среду каждые 2 до 3 дней, пока они не достигают 75-90% слияния. Клетки может занять до 3 недель, чтобы достичь 75-90% слияния. Для оптимального поколение поляризованных культуры, субкультуры клеток, прежде чем они выходят за пределы 90% слияния в виде монослоя. Продолжайте субкультуре клеток, пока достаточное количество клеток выросли на семена нужного количества вставками Transwell. Каждая вставка Transwell требует 2 × 10 5 клеток. Для достижения оптимальной производительности генерации поляризованной культуры, использовать клетки, которые подверглись не более 10 субкультур. 2. Выращивание поляризованный Calu-3 Жидкий покрытые культур (LCC) Меры безопасности: Выполнить все процедуры в кабинете биологической безопасности с использованием стерильной техники культуры. Подготовка EMEM, содержащей 10% FBS (EMEM-10%) и теплые на водяной бане до 37 ° C. Подготовка 24-а Transwell пластины для посева. Использование стерильного пинцета, переместить Transwell вставки с внутренней на внешнюю строк пластины, не касаясь вставки мембраны. Клетки должны быть только субкультивируют в скважины на внешние ряды пластины. Для предотвращения введения пузырьков воздуха в базолатеральной отсеков, добавить 600 мкл EMEM-10%, до каждого из них рыбалка пипетки к стенке каждого отделения и медленно выпуская среды в скважину. Отсоедините клетки из Т-75 см 2 ткани. Subculture колбы нагревают использованием трипсина, и мыть в 30 мл EMEM-20% + S на каждые 2 флакона трипсинизированных клеток, как описано в пункте 1.2. Тщательно промытые ресуспендирования клеток в 5 мл EMEM-10%, мягко пипетки вверх и вниз. Определить жизнеспособной и общее количество клеток по методу исключения трипанового синего. Продолжайте только если 80% – 90% являются жизнеспособными. В 50 мл стерильной коническую трубку, развести клеток в концентрации 2 × 10 6 жизнеспособных клеток / мл с EMEM-10%. Добавить клеток в апикальной отсеке каждого Transwell. Для скважин A1 и D1, который будет бесклеточной управления скважинами, то есть пробелы, добавьте 100 мкл EMEM-10% без клеток. Для каждого из остальных скважин, добавить 100 мкл ресуспендированных Calu-3 клетки, мягко рыбалка пипетки против внутренний канал руководство вкладыша стене и медленно выпуская клетки. Не касайтесь пипеткой вставки мембраны. Для поддержания однородной суспензии Calu-3 клетки, мягко агитировать клеточной суспензиив течение этого посева шаг. Инкубируйте Transwell пластины при температуре 37 ° C и 7% CO 2 в атмосфере воздуха. Место пластины в инкубатор, где физическое воздействие будет минимальным. Для повышения эффективности поляризации, не складываются плит друг на друга. Для поддержания культуры до поляризованным и готовы к использованию в экспериментах, полностью заменить среду в Transwells, как описано в шагах 2,10 через 2,13 ниже. Средний должны быть полностью заменены три дня после того, как субкультивируют в Transwells, а затем в цикле поочередно четвертая, а затем третий день после предыдущего кормления, пока клетки полностью поляризованным. Теплый EMEM-10% на водяной бане до 37 ° C. Аккуратно аспирации среды от вставки Transwell. С капиллярной пипетки прикреплены к вакуумной ловушки с нежным вакуум, или со стандартным 1 мл пипетки, аспират среды от бесклеточной скважин A1 и D1, то из посеянных скважин, в первую удаление апикальной среде от всех скважин, и тКурица удаления базолатеральную среду из всех лунок. Не прикасайтесь вставки мембран при аспирационных среды. Добавить 200 мкл EMEM-10% к апикальной отсек бесклеточной скважин A1 и D1, то к семенами скважин, направляя среды в апикальной отсека использованием стороны вставки для руководства пипетки. Не добавляйте среды непосредственно на клетки, и не прикасайтесь к вставкой мембраны. Добавить 600 мкл EMEM-10% к базолатеральной отсеков. Для предотвращения введения пузырьков воздуха в базолатеральной отсеков, добавить средне каждого из них рыбалка пипетки к стенке каждого отделения и медленно выпуская среды в скважину. 3. Оценка сопротивления развития Calu-3 LCC Меры безопасности: Выполнить все процедуры в кабинете биологической безопасности с использованием стерильной техники культуры. Оцените транс-эпителиального электрического сопротивления (TEER) из Calu-3 LCC через 30 минут послесредние изменения; оценка может быть выполнена после каждой среде изменения, если это необходимо. Выполните измерения в стерильных условиях. Начало измерений с бесклеточной контрольные лунки А1 и D1 (заготовок) для получения базовых измерений, и продолжить измерения для каждой скважины. В стерильных условиях, передает Stx2 электродом в 50 мл центрифужные пробирки, содержащие 70% этанола в стерильной воде и стерилизуют 15 мин. Калибровка и тестирование voltohmmeter для использования в соответствии с инструкциями производителя. Выньте электрод из этанола, воздух сухой 5-10 сек, и промыть электрод с стерильной EMEM-10%. Установите переключатель режима в voltohmmeter к сопротивлению настройки и включить питание. Аккуратно поместите электрод в одном из 3-х портов, которые обеспечивают доступ в базолатеральной отделение одной культуры Transwell. Место электрода так, что чем больше свинца только слегка касается нижней части внешнего хорошо и остается в вертикальном положении,и короче свинца в среде тканевой культуры апикальной отсеке, не касаясь вставки мембраны. Нажмите "Мера R" кнопку, и дождаться стабилизации показаний. Повторите эти действия для других 2 портами для каждой скважины и записывать измерения всех трех портах, в общей сложности трех измерений на лунку. Продолжить для измерения сопротивления для всех скважин клеток. Очистите электроды путем замачивания 5-10 мин в 70% этаноле, промывка в стерильных дН 2 O и сушки тщательно. Хранить в оригинальной упаковке. Рассчитать сопротивление каждой скважины, с помощью уравнения 1. Ω = Ω фактической выборки – Ω пустым, уравнение 1 где Ω образца измерения средней из посеянных хорошо и Ω бланка средний измерения от 2 скважины, A1 и D1, содержащие вставки и среднего, но не клетки. Рассчитать сопротивление на единицу площади, используя Equaния 2. Ω × фактическая эффективная площадь мембраны = Ω × см 2, уравнение 2 где эффективная площадь мембраны составляет 0,33 см 2 в течение 24-и вставки Transwell. Убедитесь, что поляризация является полным путем проведения вторичного анализа, измерения пассивной диффузии флуоресцеина натрия между апикальной и базолатеральной отсеках, на 2:59 Transwell культур. Скважин, используемых для анализа флуоресцеина натрия должна быть отброшена сразу же после завершения анализа. Подготовка нефлуоресцентного буфера (118 мМ NaCl, KCl 4,75 мм, 2,53 мМ CaCl 2 · 2H 2 O, 2,44 мМ MgSO 4; 1,19 мм KH 2 PO 4, 25 мМ NaHCO 3 в стерильной воде, стерильный фильтр с устройством фильтрации 0,45 мкм ). Подготовка флуоресцеина натрия в дозе 1 мг / мл в нефлуоресцентного буфере, стерильный фильтр, завернуть в алюминиевую фольгу и хранить при 4 ° C, в защищенном от света. Нагреться до комнатной temperatuповторно перед использованием. После завершения измерения сопротивления, осторожно снимите средние и от базолатеральной и апикальной отделения от одного до трех отдельных культур Transwell. Промыть Transwell культур. Аккуратно добавить 600 мкл при комнатной температуре стерильной PBS Дульбекко (D-PBS) в базолатеральной отделений и 100 мкл при комнатной температуре стерильной D-PBS к апикальной отсеков. Аккуратно удалите D-PBS из скважин. Добавить 600 мкл стерильной нефлуоресцентного буфера в базолатеральной отсеков. Добавить 100 мкл стерильной 1 мг / мл натрия флуоресцеина к апикальной отсеков. Инкубировать при 37 ° С в течение 1 часа. CO 2 не требуется во время этой инкубации. Во время инкубации подготовить флуоресцеина натрия стандартной кривой в диапазоне от 20 мкг / мл и 0 мкг / мл, с использованием не-флуоресцентный буфера для разбавления натрия флуоресцеина. Подготовка по крайней мере 8 различных концентраций натрия флуоресцеина, каждый в конечном объеме не менее 600 мкл. Держатьстандартном разведении кривой защищенном от света до полной готовности для измерения оптической плотности. Передача нефлуоресцентного буфера для образцов с базолатеральной отсеке каждого теста Transwell в отдельную чистую пробирку для анализа. Извлеките тест-Transwells используется для изучения пассивной диффузии флуоресцеина натрия из пластины и выбросить. Вернуться пластины с остальными Transwells в инкубатор. Поместите 100 мкл каждого стандартного раствора в трех экземплярах в 96-и плоским дном тарелку. Подготовить три разведения каждого образца базолатеральной (1:2, 1:20 и 1:50) в нефлуоресцентного буфера, и добавить 100 мкл каждого неразбавленного образца и каждого разведения в двух экземплярах, в 96-и плоским Нижняя пластина. Измерение поглощения образца на читателя ИФА на 486 нм и 490 нм. Определить концентрацию натрия флуоресцеина в базолатеральной отсек путем сравнения оптической плотности образцов от значения абсорбции для флуоресцеина натрия йAndard кривой. 4. Заражение поляризованный Calu-3 LCC с дыхательными Вирус Меры безопасности: Выполнить все процедуры в кабинете биологической безопасности с использованием стерильной техники культуры, на уровне биобезопасности подходит для вирусов используется. Развести вируса в сыворотке крови без EMEM, так что желаемого посевной бы в 100 мкл. Вымойте клетки в бессывороточной EMEM. Аккуратно аспирации среды из всех скважин, удаление апикальной среды, то базолатеральной среде. С капиллярной пипетки прикреплены к вакуумной ловушки с нежным вакуум, или со стандартным 1 мл пипетки, аспират среды от бесклеточной скважин A1 и D1, то из посеянных скважин, в первую удаление апикальной среднего из всех лунок, а затем удаление базолатеральную среду из всех лунок. Не прикасайтесь вставки мембран при аспирационных среды. Добавить 100 мкл бессывороточной EMEM к апикальной отсек бесклеточной скважин A1 и D1, а затем тОн посеян скважин, направляя среды в апикальной отсека использованием стороны вставки для руководства пипетки. Не добавляйте среды непосредственно на клетки, и не прикасайтесь к вставкой мембраны. Добавить 600 мкл бессывороточной EMEM к базолатеральной отсеков. Добавить среднего друг Transwell на рыбалку пипетки к стенке купе и медленно выпуская среды в скважину. Аккуратно аспирации бессывороточной среды из скважин. Начиная с незараженных или макет-инфицированных скважин, добавить соответствующие разведения вируса к апикальной отсек Transwells. Для неинфицированных скважин, добавить 100 мкл бессывороточной EMEM к апикальной отсек соответствующих Transwells, для макета-инфицированных скважин, добавить 100 мкл вирусов подготовки разводят в бессывороточной EMEM к апикальной отсек соответствующих Transwells, так и для вирусной инфекции, разбавить вирус в бессывороточной EMEM и добавить 100 мкл к апикальной отделений соответствующих Transwells. Добавить 600 мкл бессывороточной EMEM для всех базолатеральной отсеков. Инкубировать при 37 ° C и 7% CO 2 в течение 2 часов. Аспирируйте среды из скважин, первая из неинфицированных и макет-инфицированных скважины, то из зараженных колодцев. Удалить апикальной супернатантов первой, а затем базолатеральной супернатантах. Заменить среде с 200 мкл EMEM-10% в апикальной отделений и 600 мкл EMEM-10% в базолатеральной отсеков.