呼吸器病原体に対する宿主細胞応答を研究するために偏ヒト気道上皮Calu-3細胞の液体に覆われた文化の確立<em>インビトロ</em

1。トランスウェル培養における使用のための培養Calu-3細胞 安全対策：無菌培養技術を用いたバイオセーフティキャビネット内のすべての手順を実行します。 冷凍保存から細胞を解凍するには、次のように 20パーセントの熱不活性化ウシ胎児血清（FBS）、0.1mMの非必​​須アミノ酸、2mM L-グルタミン、および10 mMのHEPES緩衝液（pH7.4）（EMEM-20％+ S）を含むイーグル最小必須培地を準備します。 ℃の0.2μm孔サイズのフィルターを用いて調製した培地滅菌フィルタ、および37〜水浴中で暖かい現場気道上皮環境での複数の反射であるためには、媒体は、抗生物質や抗真菌剤で補充されていません。 37℃の水浴中で急速にCalu-3細胞（<1分）の凍結クライオバイアルを解凍します。 50ミリリットル滅菌コニカルチューブに解凍した細胞を移し、温めの30ミリリットルEMEM-20％+ Sを追加ペレット1,000-1,200で5分間×gでの遠心分離により細胞冷凍せずに、低ブレーキ速度を持つ。 優しく上清を除去し、優しく上下にピペッティングによって暖めEMEM-20％+ S 5mlに細胞を再懸濁する。シード2から5×ウェル当たり10 6個の細胞を、6ウェル組織培養プレートとインキュベートに37℃、空気雰囲気下で、C、7％CO 2の細胞が75％になるまで- 80％コンフルエント。毎日チェックし、最大7日間が必要になることがあります。 3〜4日毎に、細胞から培地を吸引し、新鮮EMEM-20％+ Sと交換してください継代培養細胞へ： 暖かい0.05％トリプシン – 37℃の水浴中で0.02％EDTA。過剰培地および血清を除去するために0.02％EDTA – 細胞から培地を吸引除去し、暖められた0.05％トリプシンで一回細胞を洗浄する。洗濯物を取り出して、細胞にウェルあたり温めトリプシンを1ml加える。 37℃でインキュベートし、顕微鏡下で7％のCO 2およびモニター細胞の少なくとも75％が組織培養プレートのウェル（S）から切り離されるまで、5分毎に。をこのかもしれない5〜30分かかる。 過剰トリプシンを除去するためにEMEM-20％+ Sで細胞を洗浄します。 50ミリリットル滅菌コニカルチューブにトリプシン処理した細胞を移す。 1 6ウェル培養プレートからの細胞の複数のウェルは、1つの50 mlの滅菌コニカルチューブにプールすることができる。 EMEM-20％+ Sおよびペレット1,000-1,200遠心分離によって細胞×gで、冷凍せずに、低速度でブレーキの30ミリリットルを追加します。 優しく上清を除去し、優しく上下にピペッティングすることにより新鮮なEMEM-20％+ Sで細胞を再懸濁します。 1.2.7〜ステップ1.2.5で説明したように、彼らは75の間にあるときに、細胞をトリプシン処理するには、上記1.2.3を介して手順1.2.1を使用して、組織培養皿に細胞を継代培養を続けて – 80％コンフルエント。 最大6ウェルプレートのウェル1からEMEM-20％+ Sを5 mlの最終容積1のT-25cm 2フラスコに継代培養は、0.5〜1×10 6細胞/フラスコの間に播種。 5ミリリットルを使用すると、細胞を剥離するためのT-25cm 2フラスコ、継代ごとにトリプシンを温め1、T-25cm 2フラスコから最大1までEMEM-20％+ S 10mlの最終体積中のT-75cm 2フラスコ、播種5から1の間の×10 6細胞/フラスコ。 8ミリリットルを使用すると、2のT-75cm 2フラスコに1、T-75cm 2フラスコから細胞、継代培養をデタッチし、T-75cm 2フラスコあたりトリプシンを温めた。 3新しいフラスコ：最適な細胞成長は、1親フラスコよりも大きい割合で、T-75 cm 2以上継代より大きいフラスコに継代培養細胞ません。 一度細胞は継代培養された、完全に削除して、彼らは75から90パーセントの合流点に到達するまで2〜3日ごとに培地を交換してください。細胞は、75から90パーセントのコンフルエンスに到達するために3週間ほどかかる場合があります。偏文化、サブカルチャー細胞は単層として90％コンフルエンスを超えて成長する前の最適な世代のために。 十分な細胞がシードにトランスウェルインサート数を任意の数に成長するまで継代培養細胞に進みます。各トランスウェルインサートは、2×10 5個の細胞を必要とする。偏文化を生成する最適なパフォーマンスを得るには、10以上の継代培養を受けた細胞を使用しています。 2。偏Calu-3液体に覆われた文化（LCC）の成長 安全対策：無菌培養技術を用いたバイオセーフティキャビネット内のすべての手順を実行します。 37に水浴中で、10％FBS（EMEM-10％）と暖かいを含むEMEMを準備℃に播種用の24ウェルトランスウェルプレートを準備します。滅菌ピンセットを使用して、インサート膜に触れることなく、内部からの板の外側の行にトランスウェルインサートを移動します。細胞はプレートのみの外装行上のウェルに継代培養することがあります。基底外側コンパートメントへの気泡の導入を防ぐために、それぞれの区画の壁にピペットを傾けるとゆっくりウェルに培地を放出することによって、それぞれにEMEM-10％の600μlを添加する。 T-75cm 2の組織から細胞を剥離する。 Subcultureは温めトリプシンを用いてフラスコ、そして、ステップ1.2に記載されてトリプシン処理した細胞の各2フラスコあたりのEMEM-20％+ S 30mlに洗ってください。 徹底的に優しく上下にピペッティングによりEMEM-10％の5ミリリットルで洗浄した細胞を再懸濁する。 トリパンブルー排除法により生存および総細胞数を決定します。 90パーセント生存可能である – 80％の場合にのみ行ってください。 50ミリリットル滅菌コニカルチューブに、EMEM-10％と濃度2×10 6生細胞/ mlになるように細胞を希釈します。 各トランスウェルの頂端コンパートメントにセルを追加します。無細胞対照ウェル、つまり、空白になりますウェルA1とD1、細胞なしにEMEM-10％の100μlを添加する。残りの各ウェルに、そっと挿入壁の内部ガイドチャネルに対してピペットを傾けるとゆっくり細胞を放出、再懸濁Calu-3細胞の100μlを添加する。インサート膜にピペットを触れないでください。 Calu-3細胞の均質な懸濁液を維持するために、穏やかに細胞懸濁液を攪拌この播種ステップ中。 37℃、7％の空気雰囲気中のCO 2インキュベーターで培養するトランスウェルプレート。物理的な乱れが最小限になりますインキュベーターに入れ、プレート。偏光の効率を向上させるために、互いの上にプレートを積み重ねないでください。 偏と実験で使用する準備ができるまでの文化を維持するために、完全に下に2.13〜ステップ2.10で説明したように、トランスウェルに培地を交換してください。細胞が完全に偏光している媒体が完全になるまで、3日間のトランスウェルに継代培養された後、次に以前の給餌後の第4、その後三日の間で交互のサイクルで交換する必要があります。 暖かいEMEM-10水浴中％〜37℃ 優しくトランスウェルインサートから培地を吸引除去する。穏やかな真空と真空トラップに接続されている毛細管ピペットを用いて、または標準の1ミリリットルまず、すべての井戸からアピカル培地を除去後、ピペット、無細胞ウェルA1とD1から吸引中、シード井戸から、とtと鶏は井戸から基​​底側培地を除去する。培地を吸引しながらインサート膜を触れないでください。 ピペットチップを導くためにインサートの側面を使用してアピカルコンパートメントに培地を演出し、シードウェルに、無細胞ウェルA1とD1の頂端コンパートメントにEMEM-10％の200μlを添加する。細胞に直接メディアを追加しないでください、とインサート膜に触れないでください。 基底外側コンパートメントにEMEM-10％の600μlを添加する。基底外側コンパートメントへの気泡の導入を防ぐために、それぞれの区画の壁にピペットを傾けるとゆっくりウェルに培地を放出することによって、それぞれに媒体を追加します。 3。 Calu-3 LCCの抵抗性の発達を評価する 安全対策：無菌培養技術を用いたバイオセーフティキャビネット内のすべての手順を実行します。 後Calu-3のLCC 30分の経上皮電気抵抗（TEER）を評価培地の変化;必要に応じて評価は各媒体変更後に実行することができます。無菌条件下での測定を行う。ベースライン測定値を得るために、無細胞コントロールウェルA1とD1（空白）で測定を開始し、各ウェルの測定を継続します。 無菌条件下で、滅菌水で70％のエタノールを含む50mlの遠心管にSTX2電極を転送し、15分滅菌してください。 キャリブレーションと製造者の指示に従って使用するためvoltohmmeterをテストします。 エタノール、空気乾燥した5から10秒から電極を外し、滅菌EMEM-10％で電極を洗浄してください。 抵抗設定にvoltohmmeterのモードスイッチを設定し、電源をONにしてください。 そっと1トランスウェル文化の基底外側コンパートメントにアクセスを許可する3ポートのいずれかに電極を配置します。場所電極はとても長いリードはわずかに軽く、外側の井戸の底に触れると垂直のままでいることと短いリードはインサート膜に触れることなく、アピカルコンパートメントの組織培養培地である。 "メジャーR"ボタンを押すと、安定するのを待ちます。各ウェルの他の2つのポートに対してこのステップを繰り返し、すべての3つのポートからの測定値を記録し、1ウェルあたり3の測定値の合計。細胞のすべてのウェルのための抵抗値を測定し続けています。 無菌のdH 2 Oですすぎ、よく乾燥させ、70％エタノール中で5〜10分間浸漬することによって電極を清掃してください。元の容器に保管してください。 式（1）を用いて、各ウェルの抵抗値を計算します。 Ω=Ω 実際のサンプル – Ω ブランク 、 式（1） Ωのサンプルでは、シードでなく、Ω ブランクからの平均測定値が2ウェル、A1とD1からの平均測定値を含む挿入および培地が、細胞は全くされている場所です。 方程式を用いて、単位面積抵抗を計算る2。 Ω× 実際の有効膜面積=Ω×cm 2であり 、 式（2） どこ有効膜面積は24ウェルトランスウェルインサート0.33 cm 2である。 その偏光は一から三トランスウェル培養で、頂端および側底コンパートメント間の受動フルオレセインナトリウムの拡散を測定し、二次アッセイを行うことにより完了していることを確認。フルオレセインナトリウムアッセイに用いウェルをアッセイの終了後すぐに破棄してください。 4.75のKCl;; 2.53 mMのCaCl 2·2H 2 O、2.44のMgSO 4、1.19 mMのKH 2 PO 4、25mMの滅菌水のNaHCO 3、0.45μmの濾過装置と滅菌フィルター（118 mMのNaCl非蛍光バッファを準備）。 4、光から保護℃、少なくとも非蛍光バッファー、滅菌フィルター、アルミホイルで包むと、ストア内の1 mg / mlとなるようにフルオレセインナトリウムを準備します。部屋temperatuに温まる使用前に再評価。 抵抗測定を完了した後、丁寧に一から三個々のトランスウェル文化の基底と頂端区画の両方からメディアを取り出します。 トランスウェル培養液を洗い流す。優しく心尖部のコンパートメントに基底外側コンパートメントおよび100μlの室温の滅菌、D-PBSを600μlの室温の滅菌ダルベッコPBS（D-PBS）を追加します。 優しく井戸から、D-PBSを除去します。基底外側コンパートメントに600μlの滅菌非蛍光バッファを追加します。心尖​​部のコンパートメントに100μlの滅菌1 mg / mlのフルオレセインナトリウムを追加します。 1時間37℃で静置します。 CO 2は 、このインキュベーションの間に必要とされない。 インキュベーションの間、フルオレセインナトリウムを希釈するために非蛍光性緩衝液を用いて、20μg/ mlの、0μg/ mlの間の範囲のフルオレセインナトリウムの検量線を準備してください。フルオレセインナトリウムの少なくとも8つの異なる濃度で、少なくとも600μlの最終ボリューム内の各準備をします。保つ標準曲線希釈液は、吸光度を測定する準備が整うまで、光から保護。 各テスト·トランスウェルの基底外側区画から分析のための独立したきれいなチューブに非蛍光バッファサンプルを転送します。プレートから受動フルオレセインナトリウムの拡散を調べ、破棄するために使用されるテストトランスウェルを削除します。インキュベーターに残りのトランスウェルプレートを返す。 96ウェル平底プレートに三重の各標準溶液の100μlを置きます。 非蛍光バッファ内の各基底外側サンプルの3希釈（1:2、1:20〜1:50）を用意し、二重に、各原液サンプルの、各希釈液100μLを加え、96ウェルにフラット底板。 486 nmまたは490 nmでELISAプレートリーダーでサンプルの吸光度を測定します。 フルオレセインナトリウムstの吸光度の値に対するサンプルの吸光度を比較することにより基底外側区画におけるフルオレセインナトリウムの濃度を決定andard曲線。 4。呼吸器系ウイルスを有する偏Calu-3 LCCを感染させる 安全対策：ウィルスが使用されているため、適切な生物学的安全性レベルでの無菌培養技術を用いて、バイオセーフティキャビネット内のすべてのプロシージャを実行します。 希望接種が100μlになるように、無血清EMEMでウイルスを希釈します。 無血清EMEMで細胞を洗浄します。優しくその後基底外側媒体をアピカル培地を除去し、すべてのウェルから培地を吸引除去する。穏やかな真空と真空トラップに接続されている毛細管ピペットを用いて、または標準の1ミリリットルピペット、無細胞ウェルA1とD1から吸引媒体とその後シード井戸からは、まず、すべての井戸からアピカル培地を除去した後、削除するすべてのウェルから基底外側の媒体。培地を吸引しながらインサート膜を触れないでください。 無細胞ウェルA1とD1の頂端区画し、[tに無血清EMEM 100μLを彼シードウェルは、ピペットの先端を導くためにインサートの側面を使用してアピカルコンパートメントに培地を演出。細胞に直接メディアを追加しないと、インサート膜に触れないでください。 基底外側コンパートメントに無血清EMEMの600μlを添加する。コンパートメントの壁にピペットを傾けるとゆっくりウェルに培地を放出することによって、それぞれのトランスウェルに培地を追加します。 優しく井戸から無血清培地を吸引除去する。 感染していないか、または偽感染井戸を皮切りに、トランスウェルの頂端コンパートメントに適切なウイルス希釈液を追加します。感染していない井戸のため、適切なトランスウェルの頂端コンパートメントに無血清EMEMで希釈したウイルスフリーの準備を100μlを加え、模擬感染ウェルに、適切なトランスウェルの頂端コンパートメントに無血清EMEM100μlを追加して、用ウイルス感染は、無血清EMEMでウイルスを希釈し、適切なトランスウェルの頂端コンパートメントに100μlを添加する。 すべての基底外側コンパートメントに無血清EMEMの600μlを添加する。 37℃、2時間では7％のCO 2。 その後、感染した井戸から、最初の感染していないと偽感染井戸から、井戸から培地を吸引する。基底外側清続いた最初の頂端の上清を、削除します。 頂端区画及び基底外側コンパートメントにおけるEMEM-10％の600μlのEMEM-10％200μlの培地を交換してください。