L'établissement d'une culture liquide recouvert de Airway humaines épithéliales polarisées cellules Calu-3 pour étudier la réponse cellulaire aux agents pathogènes respiratoires hôte<em> In vitro</em

1. La culture de cellules Calu-3 pour une utilisation dans les cultures Transwell Mesures de sécurité: Effectuez toutes les procédures dans une enceinte de sécurité biologique en utilisant une technique de culture stérile. Pour décongeler des cellules de congélation: Préparer Eagle milieu essentiel minimum contenant 20% de sérum de sérum fœtal bovin (FBS), 0,1 mM non-acides aminés essentiels, 2 mM de L-glutamine, et 10 mM HEPES pH 7,4 (EMEM-20% + S). -Filtre stérile au milieu préparé à l'aide d'un 0,2 um de taille de pore du filtre, et au chaud dans un bain-marie à 37 ° C. Pour être plus représentatif de l'épithélium des voies aériennes dans l'environnement in situ, moyen n'est pas supplémenté avec des antibiotiques ou antifongiques. Décongeler un tube cryogénique congelé des cellules Calu-3 rapidement (<1 min) dans un bain d'eau à 37 ° C. Transférer les cellules décongelées dans un tube conique de 50 ml stérile et ajouter 30 ml d'EMEM chauffée-20% + S. Granules des cellules par centrifugation pendant 5 min à 1000-1200 xg,sans réfrigération, et avec une vitesse de frein est bas. Décanter le surnageant et remettre en suspension délicatement les cellules dans 5 ml de EMEM chauffée-20% + S en pipetant doucement de haut en bas. Graine 2 à 5 × 10 6 cellules par puits dans une plaque à 6 puits de culture de tissu et incuber à 37 ° C, CO 7% 2 dans l'atmosphère de l'air jusqu'à ce que les cellules sont 75% – 80% de confluence. Vérifiez tous les jours, jusqu'à 7 jours peut être nécessaire. Tous les 3-4 jours aspirer le fluide à partir des cellules et le remplacer avec des produits frais EMEM-20% + S. Pour les cellules sous-culture: Chaud trypsine 0,05% – 0,02% d'EDTA dans un bain à 37 ° C. Aspirer le fluide à partir des cellules, et laver les cellules une fois avec de la trypsine 0,05% chaud – 0,02% d'EDTA pour éliminer l'excès et milieu sérique. Retirez le lavage et ajouter 1 ml de trypsine réchauffé par puits pour les cellules. Incuber à 37 ° C et 7% de CO 2 et de contrôle au microscope toutes les 5 min jusqu'à ce qu'au moins 75% des cellules détacher du puits (s) de la plaque de culture tissulaire. Cela peutprendre entre 5 et 30 min. Laver les cellules dans du EMEM-20% + S pour éliminer la trypsine excès. Transférer les cellules trypsinisées à un tube conique de 50 ml stérile. Plusieurs puits de cellules d'une plaque de culture à 6 puits peuvent être regroupés en un seul tube conique de 50 ml stérile. Ajouter 30 ml de EMEM-20% + S et sédimenter les cellules par centrifugation à 1000-1200 xg, sans réfrigération, et avec une vitesse de frein est bas. Décanter le surnageant et remettre en suspension délicatement les cellules en eau douce EMEM-20% + S en pipetant doucement de haut en bas. En utilisant les étapes 1.2.1 1.2.3 ci-dessus par le biais de trypsiniser cellules, les cellules continuent de sous-culture dans des boîtes de culture de tissus comme décrit dans les étapes 1.2.5 1.2.7 travers quand ils sont entre 75 – 80% de confluence. Subculture d'un puits d'une plaque à 6 puits jusqu'à un T-flacon de 25 cm2 dans un volume final de 5 ml de EMEM-20% + S, l'ensemencement de 0,5 à 1 × 10 6 cellules / flacon. Avec 5 ml de trypsine réchauffé par T-flacon de 25 cm2 pour détacher les cellules, sous-cultured'un T-25 cm 2 jusqu'à une fiole T-75 cm 2 ballon dans un volume final de 10 ml de milieu EMEM-20% + S, entre l'ensemencement de 1 à 5 x 10 6 cellules / flacon. Utilisation 8 ml réchauffé par la trypsine T-flacon de 75 cm2 pour détacher les cellules, d'une sous-culture T-75 cm 2 en 2 flacon T-75 cm 2 flacons. Pour une croissance optimale des cellules, les cellules ne sont pas sous-culture dans des flacons de plus de T-75 cm 2 ou sous-culture à un ratio supérieur à 1 flacon parent: 3 nouveaux flacons. Une fois que les cellules ont été repiquées, supprimer complètement et remplacer milieu tous les 2 à 3 jours jusqu'à ce qu'ils atteignent la confluence 75-90%. Les cellules peuvent prendre jusqu'à 3 semaines pour atteindre 75-90% de confluence. Pour la génération optimale des cultures de cellules polarisées, subculture, avant qu'ils cultivent au-delà de 90% de confluence en monocouche. Continuer jusqu'à ce que la sous-culture de cellules suffisamment de cellules se sont développées pour ensemencer le nombre désiré d'inserts Transwell. Chaque insert Transwell exige 2 × 10 5 cellules. Pour des performances optimales générer cultures polarisés, utiliser des cellules qui ont subi pas plus de 10 sous-cultures. 2. Croissance Polarized Calu-3 Liquide couvertes de cultures (LCC) Mesures de sécurité: Effectuez toutes les procédures dans une enceinte de sécurité biologique en utilisant une technique de culture stérile. Préparer EMEM contenant 10% de FBS (EMEM-10%) et au chaud dans un bain-marie à 37 ° C. Préparer une plaque de 24 puits Transwell pour l'ensemencement. En utilisant une pince stérile, déplacer inserts Transwell de l'intérieur aux lignes extérieures de la plaque sans toucher la membrane insert. Les cellules ne doivent être repiquées dans des puits sur les lignes extérieures de la plaque. Pour éviter l'introduction de bulles d'air dans les compartiments basolatéral, ajouter 600 ul de milieu EMEM-10% à chacun en inclinant la pipette contre la paroi de chaque compartiment et relâchant lentement le support dans le puits. Détacher les cellules de T-75 cm 2 de tissu. Par voie sousflacons lture l'aide de trypsine réchauffé, et laver dans 30 ml de EMEM-20% + S pour tous les 2 flacons de cellules trypsinisées, tel que décrit à l'étape 1.2. Bien remettre en suspension les cellules lavées dans 5 ml de EMEM-10% en pipetant doucement de haut en bas. Déterminez nombre de cellules viables totales par la méthode d'exclusion au bleu trypan. Effectuez cette opération uniquement si 80% – 90% sont viables. 50 ml dans un tube conique stérile, diluer les cellules à une concentration de 2 x 10 6 cellules viables / ml avec EMEM-10%. Ajouter à cellules du compartiment apical de chaque Transwell. Pour les puits A1 et D1, qui seront des puits de contrôle acellulaires, qui est, flans, ajouter 100 ul de MEM-10% sans cellules. Pour chacun des puits restants, ajouter 100 ul d'extrait cellules Calu-3, pêche à la ligne doucement la pipette contre le canal de guidage intérieur de la paroi d'insertion et libérant lentement les cellules. Ne touchez pas la pipette sur la membrane d'insertion. Afin de maintenir une suspension homogène de cellules Calu-3, agiter doucement la suspension cellulaireau cours de cette étape d'ensemencement. Incuber Transwell plaque à 37 ° C et 7% de CO 2 dans l'atmosphère de l'air. Placer la plaque dans un incubateur où les perturbations physiques seront minimes. Pour améliorer l'efficacité de polarisation, ne pas empiler les plaques les unes sur les autres. Pour maintenir les cultures jusqu'à polarisée et prête à l'emploi dans les expériences, remplacer complètement milieu dans Transwells, comme décrit dans les étapes 2,10 à 2.13 ci-dessous. Milieu doit être entièrement remplacé trois jours après avoir été repiquées dans Transwells, puis sur un cycle alterné entre le quatrième et troisième après l'alimentation précédente, jusqu'à ce que les cellules sont complètement polarisées. Chaud EMEM-10% dans un bain d'eau à 37 ° C. Aspirer moyenne des inserts Transwell. Avec une pipette capillaire relié à un piège à vide avec un léger vide, ou à une norme de pipette de 1 ml, moyenne aspiration de puits sans cellules A1 et D1, puis ensemencé à partir des puits, enlever premier milieu apical de tous les puits, et tpoule élimination du milieu basolatéral de tous les puits. Ne pas toucher les membranes d'insertion tout en aspirant à moyen terme. Ajouter 200 ul de milieu EMEM-10% au compartiment apical de la cellule sans puits A1 et D1, puis ensemencés dans les puits, diriger le milieu dans le compartiment apical avec le côté de l'insert pour guider la pointe de la pipette. Ne pas ajouter de support directement sur les cellules, et ne pas toucher la membrane d'insertion. Ajouter 600 ul de milieu EMEM-10% dans les compartiments basolatéral. Pour éviter l'introduction de bulles d'air dans les compartiments basolatéral, ajouter à chaque support d'une pêche à la ligne par la pipette contre la paroi de chaque compartiment et le moyen de libération lente dans le puits. 3. Développement de la résistance de l'évaluation Calu-3 LCC Mesures de sécurité: Effectuez toutes les procédures dans une enceinte de sécurité biologique en utilisant une technique de culture stérile. Évaluer trans-épithélial résistance électrique (TEER) de Calu-3 LCC 30 minutes aprèschangements de milieu, l'évaluation peut être effectuée après chaque changement de milieu si vous le souhaitez. Effectuer des mesures dans des conditions stériles. Commencez avec des mesures de contrôle acellulaire puits A1 et D1 (les blancs) pour obtenir des mesures de référence, et continuer avec les mesures pour chaque puits. Dans des conditions stériles, transférer l'électrode STX2 un tube à centrifuger de 50 ml contenant 70% d'éthanol dans de l'eau stérile, et stériliser 15 minutes. Calibrer et tester l'voltohmmeter pour une utilisation selon les instructions du fabricant. Retirer l'électrode de l'éthanol, de l'air sec 5-10 sec et rincer l'électrode avec stérile EMEM-10%. Réglez le commutateur de mode de la voltohmmeter au réglage de la résistance, et mettez sous tension. Placer doucement l'électrode dans l'un des orifices 3 qui permettent d'accéder dans le compartiment basolatéral de la culture une Transwell. Placer l'électrode de telle sorte que la tête légèrement plus seulement touche le fond du puits extérieur et reste vertical,et la plus courte est de plomb dans le milieu de culture de tissu du compartiment apical, sans toucher la membrane insert. Appuyez sur "Mesure R", et attendre que la lecture se stabilise. Répéter pour les 2 autres ports pour chaque puits et enregistrer les mesures de tous les trois ports, pour un total de trois mesures par puits. Continuer à mesurer la résistance de tous les puits de cellules. Nettoyer l'électrode par trempage 5-10 min dans de l'éthanol à 70%, rinçage à l'O stérile dH 2, et sécher soigneusement. Stocker dans le récipient d'origine. Calculer la résistance de chacun des puits, en utilisant l'équation 1. Ω = Ω réelle échantillon – Ω vide, l'équation 1 où l'échantillon Ω est la mesure moyenne d'un puits épépiné et Ω vierge est la mesure moyenne de la 2 puits, A1 et D1, contenant des inserts et des moyens, mais pas de cellules. Calculer la résistance unité de surface, à l'aide Equation 2. Ω × réelle surface de membrane efficace = Ω × cm 2, l'équation 2 où la surface de membrane efficace est de 0,33 cm 2 pour les inserts Transwell de 24 puits. Vérifiez que la polarisation est complète en effectuant un essai secondaire, la mesure de la diffusion passive de fluorescéine de sodium entre les compartiments apical et basolatéral, sur une à trois cultures Transwell. Les puits utilisés pour le dosage de fluorescéine de sodium doit être jetée immédiatement après la fin de l'essai. Préparer non fluorescent tampon (118 mM NaCl; 4,75 mM de KCl; 2,53 mM de CaCl 2 .2 H 2 O; 2,44 mM MgSO 4, 1,19 mM de KH 2 PO 4; 25 mM NaHCO 3 dans de l'eau stérile; filtre stérile de 0,45 um dispositif de filtration ). Préparer la fluorescéine de sodium à 1 mg / ml dans un tampon non fluorescent, filtre stérile, envelopper dans du papier aluminium, et conserver à 4 ° C, à l'abri de la lumière. Réchauffer à la salle de temre avant de l'utiliser. Après avoir terminé les mesures de résistance, retirez soigneusement moyen de deux compartiments basolatéral et apical de un à trois cultures Transwell individuels. Rincer cultures Transwell. Ajouter délicatement 600 ul de PBS à température ambiante stérile Dulbecco (D-PBS) pour les compartiments basolatéral et 100 pi température ambiante stériles D-PBS dans les compartiments apical. Retirez délicatement D-PBS dans les puits. Ajouter 600 ul stérile non fluorescent tampon dans les compartiments basolatéral. Ajouter 100 ul stérile 1 fluorescéine sodique mg / ml dans les compartiments apicales. Incuber la plaque à 37 ° C pendant 1 heure. CO 2 n'est pas nécessaire pendant cette incubation. Pendant l'incubation, préparer un sel de sodium de fluorescéine courbe standard comprise entre 20 pg / ml et 0 pg / ml, en utilisant non fluorescent tampon pour diluer la fluorescéine de sodium. Préparer au moins 8 différentes concentrations de fluorescéine de sodium, chacun dans un volume final de 600 pl au moins. Garderdilutions courbe standard abri de la lumière jusqu'au moment de mesurer l'absorbance. Transférer le tampon d'échantillon non fluorescent du compartiment basolatéral de chaque Transwell test pour un tube séparé propre à l'analyse. Retirer le test Transwells utilisée pour examiner la diffusion passive de fluorescéine de sodium de la plaque et le jeter. Retour à la plaque Transwells restantes à l'incubateur. Placer 100 pl de chaque solution étalon en triple dans un plat à 96 puits à fond plat. Préparer trois dilutions de chaque échantillon basolatérale (1:2, 1:20 et 1:50) dans un tampon non fluorescent, et ajouter 100 ul de chaque échantillon non dilué et de chaque dilution, en double exemplaire, dans un plat à 96 puits- plaque de fond. Absorbance de l'échantillon de mesure sur un lecteur de plaque ELISA à 486 nm ou 490 nm. Déterminer la concentration de fluorescéine de sodium dans le compartiment basolatéral en comparant l'absorbance des échantillons à l'encontre des valeurs d'absorbance pour la fluorescéine sodique ercourbe Andard. 4. Infectant Polarized Calu-3 LCC avec le virus respiratoire Mesures de sécurité: Effectuez toutes les procédures dans une enceinte de sécurité biologique en utilisant une technique de culture stérile, à un niveau de biosécurité appropriées pour le virus utilisé. Diluer virus dans le sérum sans MEM afin que inoculum désiré serait dans 100 pi. Laver les cellules dans le sérum sans MEM. Aspirer moyenne de tous les puits, enlever le milieu apical puis le milieu basolatéral. Avec une pipette capillaire relié à un piège à vide avec un léger vide, ou à une norme de pipette de 1 ml, moyenne aspiration de puits sans cellules A1 et D1, puis ensemencé à partir de puits, d'une part l'élimination du milieu apical de tous les puits, puis l'élimination du milieu basolatéral de tous les puits. Ne pas toucher les membranes d'insertion tout en aspirant à moyen terme. Ajouter 100 ul de sérum EMEM au compartiment apical de la cellule sans puits A1 et D1, puis à til ensemencée puits, de la direction moyenne dans le compartiment apical avec le côté de l'insert pour guider la pointe de la pipette. Ne pas ajouter de support directement sur les cellules, et ne pas toucher la membrane d'insertion. Ajouter 600 ul de sérum EMEM aux compartiments basolatéral. Ajouter à chaque milieu Transwell en inclinant la pipette contre la paroi du compartiment à libération lente et le milieu dans le puits. Aspirer un milieu sans sérum à partir de puits. A partir de puits non infectées ou infectées maquette, ajouter dilutions de virus appropriées pour le compartiment apical de Transwells. Pour les puits non infectés, ajouter 100 ul de sérum sans MEM dans le compartiment apical de Transwells appropriées, par pseudo-infectées puits, ajouter 100 ul de virus sans préparation dilué dans du sérum sans MEM dans le compartiment apical de Transwells appropriées, et pour infection par le virus, diluer le virus dans le sérum sans MEM et ajouter 100 ul dans les compartiments apical de Transwells appropriées. Ajouter 600 ul de sérum EMEM à tous les compartiments basolatéral. Incuber à 37 ° C et 7% de CO 2 pendant 2 heures. Aspirer moyen de puits, d'abord à partir de puits non infectés et infectés par simulation, puis à partir de puits infectés. Retirer surnageants apicaux d'abord, puis les surnageants basolatéral. Remplacer moyenne avec 200 pl de milieu EMEM-10% dans les compartiments apical et 600 ul de milieu EMEM-10% dans les compartiments basolatéral.