Экспериментальные методы изучения влияния Нейротрофических пептида ADNF-9, против пьянства-индуцированного апоптоза в период беременности у мышей C57BL / 6
Summary
Экспериментальные конструкции предлагаемого здесь сосредоточиться на изучении последствий воздействия алкоголя в апоптоз и применение нейротрофических пептида во время беременности в мозгу плода. Подробное описание из разведения в коллекцию плода мозг описывается. Методы определения апоптоза, также описаны в деталях.
Abstract
Эксперимента для изучения влияния пренатального воздействия алкоголя на ранних эмбриональных стадиях развития плода в мозге являются сложными. В основном это связано с трудностью микродиссекции мозг плода и их срезов для определения апоптоза клеток вызвано пренатального воздействия алкоголя. Эксперименты, описанные здесь методы обеспечивают визуализированных от мышей селекции для идентификации гибель клеток в эмбриональной ткани мозга. В настоящем исследовании использованы C57BL / 6 мышей, как животная модель для изучения воздействия на плод алкоголя и роль трофических пептида против алкоголь-индуцированного апоптоза. Разведения состоит из 2-часового окна маты для определения точной стадии эмбрионального возраста. Модель создана плода воздействия алкоголя была использована в данном исследовании для определения влияния пренатального воздействия алкоголя в мозге плода. Это предполагает свободный доступ к алкоголю или пару кормили жидкой диеты в качестве единственного источника питательных веществ для беременных мышей.
<p clasS = "jove_content"> способами, включающими вскрытие плода и микродиссекции мозг плода описаны тщательно, так как последняя может оказаться непростой задачей. Микродиссекция требует стереомикроскоп и ультра-тонкий пинцет. Шаг за шагом процедуры для рассечения плода мозг предоставляются визуально. Фетального мозга расчленены от основания зачатка обонятельной луковицы к основанию задний мозг.Для исследования апоптоза, фетальный мозг первая встроенная в желатиновых использованием кожуры от формы, чтобы облегчить их секционирования с Vibratome аппарата. Плод мозг вставлена и зафиксирована в параформальдегид легко срезы и свободно плавающим секции могут быть установлены в SuperFrost слайдов, а также для определения апоптоза или гибель клеток.
TUNEL (TdT-опосредованного дУТФ Ник конец маркировки; TdT: терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы) анализ используют для определения гибели клеток или апоптоза клеток. Стоит отметить, что APoptosis и клеточно-опосредованной цитотоксичности характеризуются фрагментации ДНК. Таким образом, визуализированных TUNEL-положительных клеток свидетельствует о гибели клеток или апоптоза клеток.
Экспериментальный дизайн здесь предоставляют информацию об использовании установленной жидкую диету для изучения влияния алкоголя и роль нейротрофических пептидов во время беременности в фетальных мозгов. Это включает в выращивании и откорме беременных мышей, microdissecting плода мозг и определения апоптоза. Вместе, эти визуальные и текстовые методы могут быть источником для исследования пренатального воздействия вредных веществ в мозге плода.
Introduction
Целью экспериментальных методов, описанных здесь является оценка нейропротекторное действие пептидов в трофических плода модель воздействия алкоголя с помощью нескольких методов с участием разведение, кормление, microdissecting и обнаружения гибели клеток. Работа из нашей лаборатории участвуют жидкую диету в сочетании с алкоголем в качестве модели умеренного употребления алкоголя, который может быть похож на человека в парадигме питьевой срока количество выпитого 1-5. Мы и другие определены три пептидные производные, которые являются нейропротекторное против вредных эффектов внутриутробного развития плода алкоголя. Исследования, изучающие воздействие алкоголя во время эмбрионального стадий с использованием животных моделей может привести к выявлению потенциальных механизмов нейропротекции и создать условия для развития процедуры вмешательства. Это может обеспечить достаточно информации о нейропротекторное действие и ослабления вредного воздействия выдержки спирта во время беременности.
Возможные предотвращения воздействия в пренатальной спирт может включать в лечении беременных мышей с пептидами, которые, как было показано, участвуют в нейропротекции в пробирке 6,7 и в естественных 1,2,4,8,9. Среди этих пептидов, SALLRSIPA, известные как ADNF-9 или SAL, выводится из зависимым от активности нейротрофический фактор (ADNF) 7,10. Другой пептид с последовательностью NAPVSIPQ пептид, названный NAP, полученных от активно-зависимый нейропротекторные белка (ADNP) 6,11, продемонстрировал мощный защитный эффект против окислительного стресса, связанного с воздействием алкоголя 12,13. Кроме того, в последнее время мы определили новый синтезированный пептид, colivelin который, кажется, играют ключевую роль в нейропротекторные плода модель воздействия алкоголя 2. Colivelin состоит из ADNF-9 и AGA-(C8R) HNG17 (PAGASRLLLLTGEIDLP). Важность использования этих пептидов в том, что они имеют возможностьпересечь гематоэнцефалический барьер, чтобы предотвратить воздействие алкоголя-индуцированного апоптоза и дефицита роста мозга.
Экспериментальные методы мышей C57BL / 6 для тестирования нейропротекторное действие против алкоголь-индуцированного апоптоза. Мы приняли с 2 часами окно, а не на ночь разведение того, чтобы точно оценить эмбриональный день 0 (E0), так как она может быть раскрыта путем выявления вилку сперме и влагалищных мазков 1-5. Мы использовали жидкую диету с питательные трубки, так как это будет рассматриваться как свободный доступ вместо поставки алкоголя через желудочный зонд маршруте, которые могут вызвать стресс для беременных мышей. С другой стороны, микродиссекции может быть сложной задачей в связи с мягкостью ткани плода мозга, которое может возникнуть при рассечения плода мозг на ранних эмбриональных стадиях. Здесь мы покажем, визуализировали методы для решения всех проблем связанных микродиссекции. Кроме того, поскольку срезов мозга плода также может быть сложным, мы принялиметод, который предполагает вложение мозг плода в желатиновых использованием кожуры от вложения форм. Мы добились успеха в сокращении плода мозги в свободное плавание в разделах толщиной 50 мкм. Это позволяет исследовать любые изменения содержания белка в мозге плода разделов, в том числе выявление гибели клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Методологии и технологии, представленные в этом исследовании продемонстрировать влияния пренатального воздействия алкоголя в мозге плода и роль трофических пептидов в предотвращение этих последствий. Они могут предоставить информацию о том, как изучать другие наркотики или других ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот исследовательский проект был поддержан премию Число R21AA017735 (YS) из Национального института по злоупотреблению алкоголем и алкоголизму. Материал предназначен исключительно ответственности автора и не обязательно отражают официальную точку зрения Национального института по злоупотреблению алкоголем и алкоголизму или Национального института здоровья. Автор также хотел бы поблагодарить Charisse Монтгомери за редактирование этой рукописи.
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Superfrost Plus Slides | VWR | 48311-703 | |
| PAP PEN | Research Products Int. Corp. | 195506 | |
| 5-Plend Open Mailer | Heathrow Scientific, LLC | HS 15983G | |
| Peel away embedding molds | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| In situ cell death detection kit, POD | Roche Diagnostics, Inc | 11684817910 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14170-120 | |
| Gelatin Type A | FisherScientific | G8-500 | |
| Stereomicroscope | W. NUHSBAUM, Inc | Leica M60, KL 200 LED | |
| Micro-Vibratome | Leica, Inc | Leica VT 1000S | |
| Moria Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | 2 pairs |
| Graduate 30 ml feeding tubes | Dyets, Inc | 900012 | |
| Vitamin Mix | Bio-Serv. Inc. | F8031 | |
| Mineral Mix | Bio-Serv. Inc. | F8598 | |
| Maltose Dextrin | Bio-Serv. Inc. | 3650 | |
| Ethyl alcohol 190 Proof, 5 gallons | 111000190-SS05 | Pharmco-AAPER | |
| Upright microscope | W. NUHSBAUM, Inc | LEICA DM 4000 |
References
- Sari, Y. Activity-dependent neuroprotective protein-derived peptide, NAP, preventing alcohol-induced apoptosis in fetal brain of C57BL/6 mouse. Neuroscience. 158 (4), 1426-1435 (2009).
- Sari, Y., Chiba, T., Yamada, M., Rebec, G. V., Aiso, S. A novel peptide, colivelin, prevents alcohol-induced apoptosis in fetal brain of C57BL/6 mice: signaling pathway investigations. Neuroscience. 164 (4), 1653-1664 (2009).
- Sari, Y., Hammad, L. A., Saleh, M. M., Rebec, G. V., Mechref, Y. Alteration of selective neurotransmitters in fetal brains of prenatally alcohol-treated C57BL/6 mice: quantitative analysis using liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Int. J. Dev. Neurosci. 28 (3), 263-269 (2010).
- Sari, Y., Weedman, J. M., Ge, S. Activity-dependent neurotrophic factor-derived peptide prevents alcohol-induced apoptosis, in part, through Bcl2 and c-Jun N-terminal kinase signaling pathways in fetal brain of C57BL/6 mouse. Neuroscience. 202, 465-473 (2012).
- Sari, Y., Zhang, M., Mechref, Y. Differential expression of proteins in fetal brains of alcohol-treated prenatally C57BL/6 mice: a proteomic investigation. Electrophoresis. 31, 1-14 (2010).
- Bassan, M., Zamostiano, R., Davidson, A., Pinhasov, A., Giladi, E., Perl, O., Bassan, H., Blat, C., Gibney, G., Glazner, G., Brenneman, D. E., Gozes, I. Complete sequence of a novel protein containing a femtomolar-activity-dependent neuroprotective peptide. J. Neurochem. 72 (3), 1283-1293 (1999).
- Brenneman, D. E., Hauser, J., Neale, E., Rubinraut, S., Fridkin, M., Davidson, A., Gozes, I. Activity-dependent neurotrophic factor: structure-activity relationships of femtomolar-acting peptides. J. Pharmacol. Exp. Ther. 285 (2), 619-627 (1998).
- Spong, C. Y., Abebe, D. T., Gozes, I., Brenneman, D. E., Hill, J. M. Prevention of fetal demise and growth restriction in a mouse model of fetal alcohol syndrome. J. Pharmacol. Exp. Ther. 297 (2), 774-779 (2001).
- Sari, Y., Gozes, I. Brain deficits associated with fetal alcohol exposure may be protected, in part, by peptides derived from activity-dependent neurotrophic factor and activity-dependent neuroprotective protein. Brain Res. Brain Res. Rev. 52 (1), 107-118 (2006).
- Brenneman, D. E., Gozes, I. A femtomolar-acting neuroprotective peptide. J. Clin. Invest. 97 (10), 2299-2307 (1996).
- Zamostiano, R., Pinhasov, A., Gelber, E., Steingart, R. A., Seroussi, E., Giladi, E., Bassan, M., Wollman, Y., Eyre, H. J., Mulley, J. C., Brenneman, D. E., Gozes, I. Cloning and characterization of the human activity-dependent neuroprotective protein. J. Biol. Chem. 276 (1), 708-714 (2001).
- Offen, D., Sherki, Y., Melamed, E., Fridkin, M., Brenneman, D. E., Gozes, I. Vasoactive intestinal peptide (VIP) prevents neurotoxicity in neuronal cultures: relevance to neuroprotection in Parkinson’s disease. Brain Res. 854 (1-2), 257-262 (2000).
- Steingart, R. A., Solomon, B., Brenneman, D. E., Fridkin, M., Gozes, I. VIP and peptides related to activity-dependent neurotrophic factor protect PC12 cells against oxidative stress. J. Mol. Neurosci. 15 (3), 137-145 (2000).
