Métodos experimentais para testar os efeitos de Peptide Neurotrophic, ADNF-9, contra a apoptose induzida pelo álcool durante a gravidez em camundongos C57BL / 6
Summary
O delineamento experimental proposto aqui se concentrar em estudar os efeitos da exposição ao álcool na apoptose e da aplicação de peptídeo neurotrófico durante a gravidez no cérebro fetal. Uma descrição detalhada da criação para a coleção de cérebros fetais é descrito. As técnicas para a determinação da apoptose são também descritos em detalhe.
Abstract
Projetos experimentais para investigar os efeitos da exposição pré-natal álcool durante a fase embrionária precoce em crescimento do cérebro fetal são desafiadoras. Isto é principalmente devido à dificuldade de microdissecção de cérebros fetais e de seccionamento para a determinação de células apoptóticas causadas por exposição pré-natal ao álcool. As experiências aqui descritas fornecem técnicas visualizadas a partir de ratinhos de melhoramento para a identificação de morte celular em tecido de cérebro fetal. Este estudo utilizou ratinhos C57BL / 6 como um modelo animal para o estudo da exposição do álcool fetal e o papel do péptido trófico contra a apoptose induzida por álcool. A criação consiste em uma janela de esteiras de 2 horas para determinar a fase exata da idade embrionária. Um modelo de exposição do álcool fetal estabelecida foi usado neste estudo para determinar os efeitos da exposição pré-natal de álcool nos cérebros fetais. Trata-se de livre acesso ao álcool ou par-alimentados com dietas líquidas como a única fonte de nutrientes para as ratas grávidas.
<p class = "jove_content"> As técnicas que envolvem dissecção dos fetos e microdissecção do cérebro fetal são descritos cuidadosamente, pois este pode ser um desafio. Microdissecção exige uma lupa e uma pinça ultra-finas. Procedimentos passo-a-passo para dissecar o cérebro do feto são fornecidos visualmente. Os cérebros fetais são dissecados a partir da base do bolbo olfactivo primórdio da base do metencéfalo.Para a análise da apoptose, os cérebros fetais são incorporados em primeiro lugar gelatina usando um molde da casca-de distância para facilitar o seu seccionamento com um aparelho de vibratome. Cérebros fetais embutidos e fixados em paraformaldeído são facilmente seccionado, e as secções de flutuação livre pode ser montado em Superfrost mais lâminas para a determinação da apoptose ou morte celular.
TUNEL (TdT Nick-End dUTP mediado Rotulagem; TdT: desoxinucleotidil-transferase terminal) ensaio tem sido utilizado para identificar a morte celular ou apoptose. Vale ressaltar que apoptosis e citotoxicidade mediada por células, são caracterizadas por fragmentação do DNA. Assim, as células positivas TUNEL visualizadas são indicativas de morte celular ou apoptose.
Os modelos experimentais aqui fornecem informações sobre a utilização de uma dieta líquida estabelecido para o estudo dos efeitos do álcool e o papel dos péptidos neurotróficos durante a gravidez em cérebros fetais. Trata-se de reprodução e alimentação ratas grávidas, microdissecting cérebro do feto e determinar apoptose. Juntas, estas técnicas visuais e textuais podem ser uma fonte para investigar a exposição pré-natal de agentes nocivos nos cérebros fetais.
Introduction
O objetivo dos métodos experimentais descritas aqui é avaliar os efeitos neuroprotetores de peptídeos tróficos em um modelo de exposição fetal ao álcool através de várias técnicas que envolvem a criação, alimentação, microdissecting, e detectar a morte celular. Trabalhar em nosso laboratório tem envolvido uma dieta líquida misturada com o álcool como um modelo de beber álcool moderada, o que pode ser semelhante a um paradigma de beber humano em termos de a quantidade de álcool consumido 1-5. Nós e outros autores identificaram três derivados peptídicos que são neuroprotectores contra os efeitos deletérios da exposição alcoólica fetal. Estudos que investigaram a exposição ao álcool durante os estágios embrionários utilizando modelos animais podem levar à identificação de potenciais mecanismos de neuroprotecção e permitir o desenvolvimento de procedimentos de intervenção. Isto pode fornecer uma ampla informação sobre os efeitos neuroprotectores e de atenuação dos efeitos deletérios da exposição do álcool durante a gravidez.
Possível prevenção dos efeitos do álcool exposição pré-natal pode envolver o tratamento de ratinhas grávidas com péptidos que foram mostrados para ser envolvido na neuroprotecção in vitro e in vivo 6,7 1,2,4,8,9. Entre estes péptidos, SALLRSIPA, conhecido como ADNF ou SAL-9, é derivado da actividade dependente de factor neurotrófico (ADNF) 7,10. Outro peptídeo com o NAPVSIPQ peptídeo seqüência, denominado NAP, derivado de proteína neuroprotetora dependente de atividade (ADNP) 6,11, demonstraram um efeito protetor potente contra o estresse oxidativo associado com a exposição ao álcool 12,13. Além disso, foram recentemente identificados um péptido sintetizado de novo, colivelin que parece desempenhar um papel fundamental neuroprotector no modelo de exposição fetal ao álcool 2. Colivelin é composto de ADNF-9 e AGA-(C8R) HNG17 (PAGASRLLLLTGEIDLP). A importância da utilização destes péptidos é que eles têm a capacidade deatravessam a barreira cérebro-sangue para evitar os efeitos de apoptose induzida por álcool e défices cerebrais de crescimento.
Os métodos experimentais usados camundongos C57BL / 6 para testar os efeitos neuroprotetores contra a apoptose induzida pelo álcool. Adoptámos uma janela em vez de reprodutores durante a noite 2 h de modo a determinar com precisão o dia embrionário 0 (E0), como pode ser revelado através da detecção de uma vela de esperma e esfregaço vaginal 1-5. Nós usamos uma dieta líquida com tubos de alimentação, já que este é considerado o livre acesso, em vez de entrega do álcool por via sonda gástrica, o que pode induzir estresse para ratas grávidas. Por outro lado, microdissection pode ser desafiador devido à suavidade do tecido cerebral fetal, o que pode ser encontrado ao dissecar o cérebro do feto em estágios embrionários iniciais. Aqui, vamos mostrar técnicas visualizadas para lidar com todos os desafios que envolvem microdissection. Além disso, uma vez que a secção do cérebro fetal também pode ser um desafio, adotamosuma técnica que envolve a incorporação do cérebro fetal em gelatina usando peel-away incorporação de moldes. Temos sido bem sucedidos em cortar o cérebro do feto em seções flutuantes livres a 50 m de espessura. Isto permite-nos investigar as alterações de concentração de proteína em secções de cérebro fetal, incluindo a identificação de morte celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
A metodologia e tecnologia apresentada neste estudo demonstram os efeitos da exposição pré-natal ao álcool em cérebros fetais e o papel dos péptidos tróficos na prevenção destes efeitos. Estes podem fornecer informações sobre como estudar outras drogas de abuso ou outros produtos químicos tóxicos no cérebro do feto durante as diferentes fases da gravidez.
No que diz respeito ao paradigma de reprodução, em alguns casos, a detecção do bujão de esperma não pode ser observado…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este projecto de investigação foi apoiada pelo Prêmio Número R21AA017735 (YS) do Instituto Nacional de Abuso do Álcool e Alcoolismo. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva do autor e não representam necessariamente a posição oficial do Instituto Nacional de Abuso do Álcool e Alcoolismo ou o National Institutes of Health. O autor também gostaria de agradecer a Charisse Montgomery para a edição deste manuscrito.
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Superfrost Plus Slides | VWR | 48311-703 | |
| PAP PEN | Research Products Int. Corp. | 195506 | |
| 5-Plend Open Mailer | Heathrow Scientific, LLC | HS 15983G | |
| Peel away embedding molds | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| In situ cell death detection kit, POD | Roche Diagnostics, Inc | 11684817910 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14170-120 | |
| Gelatin Type A | FisherScientific | G8-500 | |
| Stereomicroscope | W. NUHSBAUM, Inc | Leica M60, KL 200 LED | |
| Micro-Vibratome | Leica, Inc | Leica VT 1000S | |
| Moria Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | 2 pairs |
| Graduate 30 ml feeding tubes | Dyets, Inc | 900012 | |
| Vitamin Mix | Bio-Serv. Inc. | F8031 | |
| Mineral Mix | Bio-Serv. Inc. | F8598 | |
| Maltose Dextrin | Bio-Serv. Inc. | 3650 | |
| Ethyl alcohol 190 Proof, 5 gallons | 111000190-SS05 | Pharmco-AAPER | |
| Upright microscope | W. NUHSBAUM, Inc | LEICA DM 4000 |
References
- Sari, Y. Activity-dependent neuroprotective protein-derived peptide, NAP, preventing alcohol-induced apoptosis in fetal brain of C57BL/6 mouse. Neuroscience. 158 (4), 1426-1435 (2009).
- Sari, Y., Chiba, T., Yamada, M., Rebec, G. V., Aiso, S. A novel peptide, colivelin, prevents alcohol-induced apoptosis in fetal brain of C57BL/6 mice: signaling pathway investigations. Neuroscience. 164 (4), 1653-1664 (2009).
- Sari, Y., Hammad, L. A., Saleh, M. M., Rebec, G. V., Mechref, Y. Alteration of selective neurotransmitters in fetal brains of prenatally alcohol-treated C57BL/6 mice: quantitative analysis using liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Int. J. Dev. Neurosci. 28 (3), 263-269 (2010).
- Sari, Y., Weedman, J. M., Ge, S. Activity-dependent neurotrophic factor-derived peptide prevents alcohol-induced apoptosis, in part, through Bcl2 and c-Jun N-terminal kinase signaling pathways in fetal brain of C57BL/6 mouse. Neuroscience. 202, 465-473 (2012).
- Sari, Y., Zhang, M., Mechref, Y. Differential expression of proteins in fetal brains of alcohol-treated prenatally C57BL/6 mice: a proteomic investigation. Electrophoresis. 31, 1-14 (2010).
- Bassan, M., Zamostiano, R., Davidson, A., Pinhasov, A., Giladi, E., Perl, O., Bassan, H., Blat, C., Gibney, G., Glazner, G., Brenneman, D. E., Gozes, I. Complete sequence of a novel protein containing a femtomolar-activity-dependent neuroprotective peptide. J. Neurochem. 72 (3), 1283-1293 (1999).
- Brenneman, D. E., Hauser, J., Neale, E., Rubinraut, S., Fridkin, M., Davidson, A., Gozes, I. Activity-dependent neurotrophic factor: structure-activity relationships of femtomolar-acting peptides. J. Pharmacol. Exp. Ther. 285 (2), 619-627 (1998).
- Spong, C. Y., Abebe, D. T., Gozes, I., Brenneman, D. E., Hill, J. M. Prevention of fetal demise and growth restriction in a mouse model of fetal alcohol syndrome. J. Pharmacol. Exp. Ther. 297 (2), 774-779 (2001).
- Sari, Y., Gozes, I. Brain deficits associated with fetal alcohol exposure may be protected, in part, by peptides derived from activity-dependent neurotrophic factor and activity-dependent neuroprotective protein. Brain Res. Brain Res. Rev. 52 (1), 107-118 (2006).
- Brenneman, D. E., Gozes, I. A femtomolar-acting neuroprotective peptide. J. Clin. Invest. 97 (10), 2299-2307 (1996).
- Zamostiano, R., Pinhasov, A., Gelber, E., Steingart, R. A., Seroussi, E., Giladi, E., Bassan, M., Wollman, Y., Eyre, H. J., Mulley, J. C., Brenneman, D. E., Gozes, I. Cloning and characterization of the human activity-dependent neuroprotective protein. J. Biol. Chem. 276 (1), 708-714 (2001).
- Offen, D., Sherki, Y., Melamed, E., Fridkin, M., Brenneman, D. E., Gozes, I. Vasoactive intestinal peptide (VIP) prevents neurotoxicity in neuronal cultures: relevance to neuroprotection in Parkinson’s disease. Brain Res. 854 (1-2), 257-262 (2000).
- Steingart, R. A., Solomon, B., Brenneman, D. E., Fridkin, M., Gozes, I. VIP and peptides related to activity-dependent neurotrophic factor protect PC12 cells against oxidative stress. J. Mol. Neurosci. 15 (3), 137-145 (2000).
