C57BL / 6マウスにおける妊娠中のアルコール誘発性アポトーシスに対する神経栄養ペプチドの効果をテストするための実験方法、ADNF-9、
Summary
実験デザインは、ここでアポトーシスと胎児の脳内妊娠中神経ペプチドのアプリケーションでのアルコール曝露の影響を勉強に集中を提案した。育種から胎児の脳のコレクションへの詳細な説明が記載されている。アポトーシスを測定するための技術も詳細に説明する。
Abstract
胎児の脳の成長の初期胚の段階で出生前のアルコール暴露の影響を調査するための実験的なデザインが挑戦しています。これは主に胎児の脳の顕微解剖の難しさとアルコールへの出生前暴露により引き起こされるアポトーシス細胞の決定のためにそれらの切片によるものです。実験では、胎児の脳組織における細胞死の同定に繁殖マウスから可視化技術を提供ここで説明する。この研究は、C57BL /胎児のアルコール暴露とアルコール誘発性アポトーシスに対する栄養ペプチドの役割を研究するための動物モデルとして6マウスを使用していました。繁殖は、胚の年齢の正確な段階を決定するために、2時間マットウィンドウで構成されています。確立された胎児のアルコール暴露モデルは、胎児の脳における出生前のアルコール暴露の影響を決定するために、この研究で使用されている。これは、妊娠マウスのために栄養素の唯一の供給源としてアルコールやペアフィード流動食への無料アクセスが含まれます。
<p clasS = "jove_content">胎児と胎児の脳の顕微解剖の解剖に関わる技術は、後者は挑戦することができますので、丁寧に説明されています。顕微解剖は、実体顕微鏡と超微細鉗子を必要とします。胎児の脳を解剖するためのステップバイステップの手順を視覚的に提供されています。胎児の脳原基嗅球のベースから後脳のベースに解剖されています。アポトーシスを調べるために、胎児の脳を第ビブラトーム切片装置との剥離を容易にするために、離れて金型を用いて、ゼラチンに埋め込まれている。パラホルムアルデヒドに埋め込まれ、固定された胎児の脳を容易に区画され、遊離浮遊切片は、アポトーシスまたは細胞死の決定のためsuperfrostプラススライドに装着することができる。
TUNEL（TdTを媒介性dUTPニック末端標識、TdTを：ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ）アッセイは、細胞死またはアポトーシス細胞を同定するために使用されている。これは、APのことは注目に値するoptosisおよび細胞媒介性細胞傷害性は、DNAの断片化によって特徴付けられる。したがって、可視TUNEL陽性細胞は、細胞死またはアポトーシス細胞を示す。
ここで実験的なデザインは、アルコールと胎児の脳内妊娠中神経ペプチドの役割の効果を研究するための確立された流動食の使用に関する情報を提供します。これは、繁殖と妊娠マウスを供給する、胎児の脳をmicrodissecting、およびアポトーシスを決定することを含む。一緒に、これらのビジュアルとテキスト技術は胎児の脳中の有害物質の胎児期曝露を調査するための源であるかもしれません。
Introduction
ここに記載の実験方法の目的は、摂食microdissecting、及び細胞死を検出し、繁殖を含むいくつかの技法を用いて胎児のアルコール暴露モデルにおいて栄養ペプチドの神経保護効果を評価することである。我々の研究室からの仕事は1-5消費アルコールの量の長期的に人間の飲用パラダイムのようになります適度な飲酒のモデルとしてアルコールと混合された流動食を必要としてきた。我々と他の人が胎児のアルコール暴露の有害な影響に対して神経保護の3つのペプチド誘導体を同定した。動物モデルを用いた胚の段階でアルコール暴露を調査研究は、神経保護潜在的なメカニズムの同定につながり、介入手順の開発を可能にすることができる。これは、妊娠中のアルコール暴露の有害な影響の神経保護効果及び減衰に関する十分な情報を提供することができる。
出生前のアルコール暴露の影響の可能性の予防は、in vitro 6,7 で神経保護およびin vivo 1,2,4,8,9 に関与することが示されているペプチドで妊娠マウスの治療を含むことができる。これらのペプチドのうち、ADNF-9またはSALとして知らSALLRSIPAは、活動依存神経栄養因子（ADNF）7,10から派生しています。活動依存神経保護タンパク質（ADNP）6,11、由来の配列NAPVSIPQペプチドと呼ばれるNAPのもう一つのペプチドは、アルコール暴露12,13に関連付けられている酸化ストレスに対する強力な保護効果を示した。また、最近、胎児のアルコール暴露モデル2における重要な神経保護の役割を果たすと思われる新規合成したペプチド、colivelinを同定した。 ColivelinはADNF-9とAGA-（C8R）HNG17（PAGASRLLLLTGEIDLP）で構成されています。これらのペプチドの使用の重要性は、それらの能力を有することであるアルコール誘発性アポトーシスおよび脳の成長欠損の影響を防ぐために、血液脳関門を通過する。
実験方法は、アルコール誘発性アポトーシスに対する神経保護効果をテストするためにC57BL / 6マウスを使用していました。我々はそれが精子プラグと膣スメア1-5の検出により明らかにすることができるように正確に、胚の日を0（E0）を推定するために、代わりに一晩の繁殖の2時間窓を採用しています。これはフリーアクセスの代わりに妊娠したマウスにストレスを誘導することが強制経口経路を通じてアルコールの配信と考えられているように我々は、栄養チューブで流動食を使用している。一方、マイクロダイセクションは、初期胚の段階で胎児の脳を解剖したときに発生することがあり胎児の脳組織の柔らかさに起因して挑戦することができます。ここでは、マイクロダイセクションを含むすべての課題に対処するための可視化手法を示す。さらに、胎児の脳切片にも挑戦することができますので、我々は採用しているゼラチン埋め込むピールアウェイ用いた金型で胎児の脳を埋め込む伴う手法。私たちは、50ミクロンの厚さで自由に浮遊セクションで胎児の脳の切断に成功している。これは、私たちは、細胞死の識別を含む、胎児の脳切片におけるコンテンツタンパク質の任意の変化を調べることができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究で提示方法論と技術は出生前の胎児の脳のアルコールへの暴露とこれらの効果の予防に栄養ペプチドの役割の効果を実証する。これらは別の妊娠段階で胎児の脳で虐待や他の有毒化学物質の他の薬剤を研究する方法についての情報を提供することができる。
繁殖パラダイムに関しては、いくつかのケースでは精子プラグの検出が観察されないことがあります。こ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究プロジェクトは、アルコール乱用やアルコール依存症、国立研究所から受賞番号R21AA017735（YS）によってサポートされていました。内容は、執筆者の個人的責任であり、必ずしもアルコール乱用やアルコール依存症や国立衛生研究所、国立研究所の公式見解を表すものではありません。筆者もこの原稿を編集するためのチャリシーモンゴメリに感謝したいと思います。
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Superfrost Plus Slides | VWR | 48311-703 | |
| PAP PEN | Research Products Int. Corp. | 195506 | |
| 5-Plend Open Mailer | Heathrow Scientific, LLC | HS 15983G | |
| Peel away embedding molds | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| In situ cell death detection kit, POD | Roche Diagnostics, Inc | 11684817910 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14170-120 | |
| Gelatin Type A | FisherScientific | G8-500 | |
| Stereomicroscope | W. NUHSBAUM, Inc | Leica M60, KL 200 LED | |
| Micro-Vibratome | Leica, Inc | Leica VT 1000S | |
| Moria Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | 2 pairs |
| Graduate 30 ml feeding tubes | Dyets, Inc | 900012 | |
| Vitamin Mix | Bio-Serv. Inc. | F8031 | |
| Mineral Mix | Bio-Serv. Inc. | F8598 | |
| Maltose Dextrin | Bio-Serv. Inc. | 3650 | |
| Ethyl alcohol 190 Proof, 5 gallons | 111000190-SS05 | Pharmco-AAPER | |
| Upright microscope | W. NUHSBAUM, Inc | LEICA DM 4000 |
References
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