Metodi sperimentali per testare gli effetti del peptide neurotrofico, ADNF-9, Contro L'apoptosi indotta da alcol durante la gravidanza in topi C57BL / 6
Summary
I disegni sperimentali proposti qui concentrarsi sullo studio degli effetti dell'esposizione alcol in apoptosi e l'applicazione del peptide neurotrofico durante la gravidanza nel cervello del feto. Una descrizione dettagliata dall'allevamento alla raccolta di cervelli fetali è descritto. Tecniche per la determinazione di apoptosi sono anche descritte in dettaglio.
Abstract
Disegni sperimentali per indagare gli effetti dell'esposizione prenatale durante le prime fasi embrionali in crescita del cervello del feto sono impegnative. Ciò è dovuto principalmente alla difficoltà di microdissezione dei cervelli fetali e loro sezionamento per la determinazione delle cellule apoptotiche causate dall'esposizione prenatale all'alcol. Gli esperimenti qui descritti fornire tecniche visualizzati da topi allevamento all'identificazione della morte cellulare nel tessuto cerebrale fetale. Questo studio ha utilizzato C57BL / 6 topi come modello animale per studiare l'esposizione fetale alcol e ruolo trofico peptide contro l'apoptosi indotta da alcol. L'allevamento costituita da una finestra stuoia 2-ore per determinare lo stadio esatto di età embrionale. Un modello di esposizione fetale alcolico stabilito è stato utilizzato in questo studio per determinare gli effetti dell'esposizione prenatale dell'alcool nel cervello fetale. Questo comporta il libero accesso a alcol o pair-fed diete liquide come unica fonte di nutrimento per i topi in gravidanza.
<p class = "jove_content"> Le tecniche che coinvolgono la dissezione dei feti e microdissezione dei cervelli fetali sono descritti con cura, in quanto quest'ultimo può essere impegnativo. Microdissezione richiede uno stereomicroscopio e ultra-pinza sottile. Procedure passo-passo per sezionare il cervello del feto sono forniti visivamente. I cervelli fetali sono sezionati dalla base del bulbo olfattivo primordium alla base del metencephalon.Per indagare l'apoptosi, cervelli fetali vengono prima inseriti in gelatina con una buccia-away stampo per facilitare il loro sezionamento con un apparato vibratome. Cervelli fetali incorporati e fissati in paraformaldeide sono facilmente sezionato, e le sezioni fluttuanti possono essere montati in SuperFrost più vetrini per la determinazione di apoptosi o morte cellulare.
TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick End Labeling; TdT: terminale deoxynucleotidyl transferasi) test è stato utilizzato per identificare la morte delle cellule o di cellule apoptotiche. È interessante notare che apoptosis e citotossicità cellulo-mediata sono caratterizzati dalla frammentazione del DNA. Così, le cellule TUNEL-positive visualizzati sono indicativi di morte cellulare o cellule apoptotiche.
I disegni sperimentali qui forniscono informazioni circa l'uso di una dieta liquida stabilito per studiare gli effetti di alcool e il ruolo dei peptidi neurotrofici durante la gravidanza, nel cervello del feto. Ciò comporta allevamento e di alimentazione topi in gravidanza, microdissecting cervelli fetali, e determinando l'apoptosi. Insieme, queste tecniche visive e testuali potrebbero essere una fonte per indagare l'esposizione prenatale di agenti nocivi nel cervello del feto.
Introduction
L'obiettivo dei metodi sperimentali descritti qui è quello di valutare gli effetti neuroprotettivi di peptidi trofiche in un modello di esposizione alcolica fetale utilizzando diverse tecniche che comportano l'allevamento, l'alimentazione, microdissecting, e rilevando la morte cellulare. Lavora dal nostro laboratorio ha coinvolto una dieta liquida mescolata con alcol come un modello di consumo di alcol moderato, che potrebbe essere simile a un bere paradigma umano in termini di quantità di alcol consumato 1-5. Noi e altri abbiamo identificato tre derivati peptidici che sono neuroprotettivo contro gli effetti deleteri di esposizione alcolica fetale. Studi che hanno valutato l'esposizione di alcol durante le fasi embrionali utilizzando modelli animali possono portare all'identificazione di potenziali meccanismi di neuroprotezione e consentire lo sviluppo di procedure di intervento. Questo può fornire ampie informazioni sugli effetti neuroprotettivi e di attenuazione degli effetti deleteri di esposizione alcol durante la gravidanza.
Possibile prevenzione degli effetti dell'esposizione prenatale può comportare il trattamento di topi in gravidanza con peptidi che hanno dimostrato di essere coinvolti in neuroprotezione in vitro e in vivo 6,7 1,2,4,8,9. Tra questi peptidi, SALLRSIPA, noto come ADNF-9 o SAL, è derivato da attività dipendente fattore neurotrofico (ADNF) 7,10. Un altro peptide con la sequenza NAPVSIPQ peptide, PNA definito, derivato dalla proteina neuroprotettiva attività-dipendente (ADNP) 6,11, dimostrato un potente effetto protettivo contro lo stress ossidativo associato con l'esposizione di alcol 12,13. Inoltre, abbiamo recentemente identificato un nuovo peptide sintetizzato, colivelin che sembra giocare un ruolo chiave nel neuroprotettivo alcool modello esposizione fetale 2. Colivelin è composto ADNF-9 e-AGA (C8R) HNG17 (PAGASRLLLLTGEIDLP). L'importanza dell'uso di questi peptidi è che hanno la capacità diattraversare la barriera sangue-cervello per evitare che gli effetti di apoptosi indotta da alcol e deficit di crescita del cervello.
I metodi sperimentali utilizzati C57BL / 6 topi per testare gli effetti neuroprotettivi contro l'apoptosi indotta da alcol. Abbiamo adottato una finestra 2-ore anziché overnight allevamento al fine di stimare con precisione il giorno embrionale 0 (E0), come può essere rivelato dal rilevamento di una spina sperma e striscio vaginale 1-5. Abbiamo usato una dieta liquida con tubi di alimentazione, in quanto questo è considerato libero accesso al posto di consegna di alcol attraverso la via sonda gastrica, che può indurre stress a topi in gravidanza. D'altra parte, microdissezione può essere difficile a causa della morbidezza del tessuto cerebrale fetale, che si possono verificare durante la dissezione cervelli fetali in primi stadi embrionali. Qui vi mostriamo le tecniche visualizzati per affrontare tutte le sfide che coinvolgono microdissezione. Inoltre, poiché il sezionamento cervello fetale può anche essere impegnativo, abbiamo adottatouna tecnica che prevede l'incorporamento il cervello del feto in gelatina con pelabile incorporamento stampi. Abbiamo avuto successo nel ridurre i cervelli fetali nelle sezioni fluttuanti a 50 micron di spessore. Questo ci permette di indagare eventuali alterazioni delle proteine contenuti in sezioni di cervello fetale, compresa l'individuazione di morte cellulare.
Protocol
Representative Results
Discussion
La metodologia e la tecnologia presentata in questo studio dimostrano gli effetti dell'esposizione prenatale ad alcol nel cervello fetale e il ruolo dei peptidi trofici nella prevenzione di questi effetti. Questi possono fornire informazioni sul modo di studiare altre sostanze d'abuso o di altre sostanze chimiche tossiche nel cervello del feto durante le diverse fasi della gravidanza.
Riguardo il paradigma allevamento, in alcuni casi la rilevazione della spina spermatozoi potrebbe no…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo progetto di ricerca è stata sostenuta da Premio Numero R21AA017735 (YS) dagli Istituti nazionale su abuso di alcool e l'alcolismo. Il contenuto è di esclusiva responsabilità dell'autore e non rappresentano necessariamente le opinioni ufficiali dell'Istituto nazionale su abuso di alcool e l'alcolismo o la National Institutes of Health. L'autore desidera inoltre ringraziare Charisse Montgomery per la modifica di questo manoscritto.
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Superfrost Plus Slides | VWR | 48311-703 | |
| PAP PEN | Research Products Int. Corp. | 195506 | |
| 5-Plend Open Mailer | Heathrow Scientific, LLC | HS 15983G | |
| Peel away embedding molds | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| In situ cell death detection kit, POD | Roche Diagnostics, Inc | 11684817910 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14170-120 | |
| Gelatin Type A | FisherScientific | G8-500 | |
| Stereomicroscope | W. NUHSBAUM, Inc | Leica M60, KL 200 LED | |
| Micro-Vibratome | Leica, Inc | Leica VT 1000S | |
| Moria Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | 2 pairs |
| Graduate 30 ml feeding tubes | Dyets, Inc | 900012 | |
| Vitamin Mix | Bio-Serv. Inc. | F8031 | |
| Mineral Mix | Bio-Serv. Inc. | F8598 | |
| Maltose Dextrin | Bio-Serv. Inc. | 3650 | |
| Ethyl alcohol 190 Proof, 5 gallons | 111000190-SS05 | Pharmco-AAPER | |
| Upright microscope | W. NUHSBAUM, Inc | LEICA DM 4000 |
References
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