שיטות ניסיוניות לבדיקת ההשפעות של הפפטיד neurotrophic, ADNF-9, נגד אפופטוזיס מושרה אלכוהול במהלך הריון בעכברי C57BL / 6
Summary
את העיצובים הניסיוניים מוצעים כאן מתמקד בחקר ההשפעות של חשיפה לאלכוהול באפופטוזיס והיישום של פפטיד neurotrophic במהלך ההריון במוח של העובר. תיאור מפורט מהרבייה לאוסף של מוח העובר מתואר. טכניקות לקביעת אפופטוזיס גם מתוארות בפירוט.
Abstract
עיצובים ניסיוניים לחוקרים את ההשפעות של חשיפת אלכוהול טרום לידתי בשלבים עובריים מוקדמים בצמיחת המוח העוברית מאתגרים. זה בעיקר בשל הקושי של microdissection של מוח העובר וחתכם להגדרה של תאים אפופטוטיים הנגרמים על ידי חשיפה טרום לידתי לאלכוהול. הניסויים שתוארו כאן לספק טכניקות דמיינו מעכברי רבייה לזיהוי של מוות של תאים ברקמת המוח עוברי. מחקר זה משמש C57BL / 6 עכברים כמודל חיה ללימוד חשיפת אלכוהול עוברית ותפקידיו של פפטיד trophic נגד אפופטוזיס המושרה באלכוהול. הרבייה מורכבת מחלון מחצלת 2-HR כדי לקבוע את השלב של גיל עוברי המדויק. מודל חשיפת אלכוהול עוברי שהוקם כבר בשימוש במחקר זה כדי לקבוע את ההשפעות של חשיפת אלכוהול טרום לידתי במוח העובר. זה כולל גישה החופשית לדיאטות נוזליות אלכוהול או זוג שייזון כמקור הבלעדי של חומרים מזינים לעכברים בהריון.
<p clasS = "jove_content"> הטכניקות מעורבות נתיחה של עוברים וMicrodissection של מוח העובר מתוארות בזהירות, שכן זו האחרונה יכולה להיות מאתגרת. Microdissection דורש stereomicroscope ומלקחי Ultra-בסדר. הליכי שלב אחר שלב ללנתח את המוח העובר מסופקים מבחינה ויזואלית. המוח העוברי הם גזורים מהבסיס של הנורה חוש הריח primordium לבסיס metencephalon.על חקירת אפופטוזיס, מוח עוברי מוטבע ראשון בג'לטין באמצעות קליפת עובש משם כדי להקל על חתך שלהם עם מנגנון vibratome. המוח עוברי המשובצים והקבועים paraformaldehyde בקלות מחולק, ויכולים להיות מותקנים בסעיפים הצפים חינם בשקופיות בתוספת SuperFrost לנחישות של אפופטוזיס או מוות של תאים.
Tunel (תיוג TdT בתיווך dUTP ניק הסוף; TdT: מסוף deoxynucleotidyl transferase) assay כבר משמש לזיהוי מות תא או תאים אפופטוטיים. ראוי לציין כי apoptosis וcytotoxicity בתיווך התא מאופיין בפיצול ה-DNA. לכן, התאים Tunel החיוביים דמיינו מעידים על מות תא או תאים אפופטוטיים.
את העיצובים הניסיוניים כאן לספק מידע על השימוש בדיאטת נוזלים שהוקמו לחקר ההשפעות של אלכוהול ואת התפקיד של פפטידים neurotrophic במהלך ההריון במוח העובר. זה כרוך בגידול והאכלת עכברים בהריון, microdissecting מוח העובר, וקביעת אפופטוזיס. יחד, טכניקות חזותיות והטקסטואלי אלה עשויות להיות מקור לחקירת חשיפה טרום לידתי של גורמים מזיקים במוח העובר.
Introduction
המטרה של השיטות הניסיוניות שתוארו כאן היא להעריך את ההשפעות של פפטידים neuroprotective trophic במודל חשיפת אלכוהול עוברי באמצעות מספר טכניקות מעורבות רבייה, האכלה, microdissecting, וגילוי מוות של תאים. לעבוד מהמעבדה שלנו הייתה כרוך בדיאטה נוזלית מעורבבת עם אלכוהול כמודל של שתיית אלכוהול מתונה, אשר עשוי להיות דומה לפרדיגמה שתיית אדם בטווח של כמות האלכוהול נצרך 1-5. אנו ואחרים זיהו שלושה נגזרי פפטיד שneuroprotective מפני ההשפעות המזיקות של חשיפה לאלכוהול עוברי. מחקרים חוקרים חשיפה לאלכוהול במהלך שלבים עובריים תוך שימוש במודלים של בעלי חיים עלולים להוביל לזיהוי של מנגנונים אפשריים של neuroprotection ולאפשר פיתוח של הליכי התערבות. זה עשוי לספק מידע נרחב על השפעות neuroprotective וההנחתה של ההשפעות המזיקות של חשיפה לאלכוהול במהלך הריון.
מניעה אפשרית של ההשפעות של חשיפת אלכוהול טרום לידתי עשויה להיות כרוכה בטיפול בעכברים בהריון עם פפטידים אשר הוכחו להיות מעורבות בneuroprotection במבחנה 6,7 ו in vivo 1,2,4,8,9. בין פפטידים אלה, SALLRSIPA, המכונה ADNF-9 או סל, נגזר מהפעילות תלוי גורם נוירוטרופי (ADNF) 7,10. פפטיד נוסף עם רצף NAPVSIPQ פפטיד, NAP כינה, הנגזר מחלבון neuroprotective פעילות תלויה (ADNP) 6,11, הפגין אפקט מגן מפני סטרס חמצונים חזק הקשורים לחשיפת אלכוהול 12,13. בנוסף, לאחרונה זיהו פפטיד, colivelin חדש מסונתז שמופיע לשחק תפקיד מפתח בneuroprotective מודל חשיפת האלכוהול העוברי 2. Colivelin מורכב מADNF-9 ו-AGA (C8R) HNG17 (PAGASRLLLLTGEIDLP). את החשיבות של השימוש בפפטידים אלה היא שיש להם את היכולתלחצות את מחסום דם המוח כדי למנוע את ההשפעות של אפופטוזיס אלכוהול וגירעונות גדילת מוח.
השיטות הניסיוניות השתמשו בעכברי C57BL / 6 לבדיקת השפעות neuroprotective נגד אפופטוזיס המושרה באלכוהול. אנחנו אימצו חלון 2-HR במקום רבייה הלילה על מנת להעריך במדויק את היום העוברי 0 (E0), כפי שיכול להתגלות על ידי זיהוי של התוספת זרע ולמרוח בנרתיק 1-5 זה. אנחנו השתמשנו בדיאטת נוזלים עם צינורות האכלה, כמו זה נחשב גישה החופשית במקום משלוח של אלכוהול דרך מסלול gavage, אשר עשוי לגרום ללחץ לעכברים בהריון. מצד השני, יכול להיות מאתגר microdissection בשל הרכות של רקמת המוח העוברית, אשר עשוי להיות נתקלו כאשר לנתח מוח עוברי בשלבים עובריים מוקדמים. כאן, אנו מציגים טכניקות דמיינו כדי להתמודד עם כל האתגרים הכרוכים בmicrodissection. יתר על כן, מאחר שחתך המוח העוברי גם יכול להיות מאתגר, אימצנוטכניקה שכרוכה בהטבעת המוח העוברי בתבניות באמצעות קליפה משם הטבעת ג'לטין. יש לנו כבר בהצלחה בחיתוך המוח העוברי בסעיפים חופשיים שצפו בעובי 50 מיקרומטר. זה מאפשר לנו לחקור את כל שינויים של חלבון תוכן בחלקים במוח עוברי, כולל זיהוי של מוות של תאים.
Protocol
Representative Results
Discussion
המתודולוגיה והטכנולוגיה שהוצגה במחקר זה מדגימים את ההשפעות של חשיפה טרום לידתי לאלכוהול במוח העובר ואת התפקיד של פפטידים trophic במניעת תופעות אלה. אלה עשויים לספק מידע על איך ללמוד תרופות אחרות של התעללות או כימיקלים רעילים אחרים במוח העובר בשלבי הריון שונים.
<p class="j…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
פרויקט מחקר זה נתמך על ידי מספר פרס R21AA017735 (י"ש) מהמכון הלאומי על אלכוהול התעללות ועל אלכוהוליזם. התוכן הוא באחריות בלעדית של המחבר ואינו מייצגים בהכרח את עמדתה הרשמית של המכון הלאומי על אלכוהול התעללות ועל אלכוהוליזם או המכונים הלאומי לבריאות. המחבר גם רוצה להודות לאריס מונטגומרי לעריכת כתב היד הזה.
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Superfrost Plus Slides | VWR | 48311-703 | |
| PAP PEN | Research Products Int. Corp. | 195506 | |
| 5-Plend Open Mailer | Heathrow Scientific, LLC | HS 15983G | |
| Peel away embedding molds | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| In situ cell death detection kit, POD | Roche Diagnostics, Inc | 11684817910 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14170-120 | |
| Gelatin Type A | FisherScientific | G8-500 | |
| Stereomicroscope | W. NUHSBAUM, Inc | Leica M60, KL 200 LED | |
| Micro-Vibratome | Leica, Inc | Leica VT 1000S | |
| Moria Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | 2 pairs |
| Graduate 30 ml feeding tubes | Dyets, Inc | 900012 | |
| Vitamin Mix | Bio-Serv. Inc. | F8031 | |
| Mineral Mix | Bio-Serv. Inc. | F8598 | |
| Maltose Dextrin | Bio-Serv. Inc. | 3650 | |
| Ethyl alcohol 190 Proof, 5 gallons | 111000190-SS05 | Pharmco-AAPER | |
| Upright microscope | W. NUHSBAUM, Inc | LEICA DM 4000 |
References
- Sari, Y. Activity-dependent neuroprotective protein-derived peptide, NAP, preventing alcohol-induced apoptosis in fetal brain of C57BL/6 mouse. Neuroscience. 158 (4), 1426-1435 (2009).
- Sari, Y., Chiba, T., Yamada, M., Rebec, G. V., Aiso, S. A novel peptide, colivelin, prevents alcohol-induced apoptosis in fetal brain of C57BL/6 mice: signaling pathway investigations. Neuroscience. 164 (4), 1653-1664 (2009).
- Sari, Y., Hammad, L. A., Saleh, M. M., Rebec, G. V., Mechref, Y. Alteration of selective neurotransmitters in fetal brains of prenatally alcohol-treated C57BL/6 mice: quantitative analysis using liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Int. J. Dev. Neurosci. 28 (3), 263-269 (2010).
- Sari, Y., Weedman, J. M., Ge, S. Activity-dependent neurotrophic factor-derived peptide prevents alcohol-induced apoptosis, in part, through Bcl2 and c-Jun N-terminal kinase signaling pathways in fetal brain of C57BL/6 mouse. Neuroscience. 202, 465-473 (2012).
- Sari, Y., Zhang, M., Mechref, Y. Differential expression of proteins in fetal brains of alcohol-treated prenatally C57BL/6 mice: a proteomic investigation. Electrophoresis. 31, 1-14 (2010).
- Bassan, M., Zamostiano, R., Davidson, A., Pinhasov, A., Giladi, E., Perl, O., Bassan, H., Blat, C., Gibney, G., Glazner, G., Brenneman, D. E., Gozes, I. Complete sequence of a novel protein containing a femtomolar-activity-dependent neuroprotective peptide. J. Neurochem. 72 (3), 1283-1293 (1999).
- Brenneman, D. E., Hauser, J., Neale, E., Rubinraut, S., Fridkin, M., Davidson, A., Gozes, I. Activity-dependent neurotrophic factor: structure-activity relationships of femtomolar-acting peptides. J. Pharmacol. Exp. Ther. 285 (2), 619-627 (1998).
- Spong, C. Y., Abebe, D. T., Gozes, I., Brenneman, D. E., Hill, J. M. Prevention of fetal demise and growth restriction in a mouse model of fetal alcohol syndrome. J. Pharmacol. Exp. Ther. 297 (2), 774-779 (2001).
- Sari, Y., Gozes, I. Brain deficits associated with fetal alcohol exposure may be protected, in part, by peptides derived from activity-dependent neurotrophic factor and activity-dependent neuroprotective protein. Brain Res. Brain Res. Rev. 52 (1), 107-118 (2006).
- Brenneman, D. E., Gozes, I. A femtomolar-acting neuroprotective peptide. J. Clin. Invest. 97 (10), 2299-2307 (1996).
- Zamostiano, R., Pinhasov, A., Gelber, E., Steingart, R. A., Seroussi, E., Giladi, E., Bassan, M., Wollman, Y., Eyre, H. J., Mulley, J. C., Brenneman, D. E., Gozes, I. Cloning and characterization of the human activity-dependent neuroprotective protein. J. Biol. Chem. 276 (1), 708-714 (2001).
- Offen, D., Sherki, Y., Melamed, E., Fridkin, M., Brenneman, D. E., Gozes, I. Vasoactive intestinal peptide (VIP) prevents neurotoxicity in neuronal cultures: relevance to neuroprotection in Parkinson’s disease. Brain Res. 854 (1-2), 257-262 (2000).
- Steingart, R. A., Solomon, B., Brenneman, D. E., Fridkin, M., Gozes, I. VIP and peptides related to activity-dependent neurotrophic factor protect PC12 cells against oxidative stress. J. Mol. Neurosci. 15 (3), 137-145 (2000).
