Experimentele methoden voor het testen van de effecten van Neurotrophic Peptide, ADNF-9, Tegen Alcohol-geïnduceerde apoptose tijdens de zwangerschap in C57BL / 6 muizen
Summary
De experimentele ontwerpen voorgesteld hier richten op het bestuderen van de effecten van blootstelling aan alcohol in apoptose en de toepassing van neurotrophic peptide tijdens de zwangerschap in de foetale hersenen. Een gedetailleerde beschrijving van de kweek tot de verzameling van foetale hersenen beschreven. Technieken voor de bepaling van apoptose nader omschreven.
Abstract
Experimentele ontwerpen voor onderzoek naar de effecten van prenatale blootstelling aan alcohol tijdens de vroege embryonale stadia in de groei van de foetus hersenen zijn uitdagend. Dit is vooral te wijten aan de moeilijkheid van microdissectie van foetale hersenen en het snijden voor het bepalen van apoptotische cellen door prenatale blootstelling aan alcohol. De hier beschreven experimenten geven gevisualiseerd technieken muizen fokken tot de identificatie van celdood in foetaal hersenweefsel. Deze studie gebruikte C57BL / 6 muizen als diermodel voor de studie van foetaal alcohol blootstelling en de rol van trofische peptide tegen alcohol-geïnduceerde apoptose. De kweek bestaat uit een 2-uur venster matten om de exacte fase van de embryonale leeftijd. Een gevestigde foetale model alcoholblootstelling is gebruikt in deze studie om de effecten van prenatale blootstelling aan alcohol in foetale hersenen bepalen. Het gaat om de vrije toegang tot alcohol of paargevoede vloeibaar dieet als de enige bron van voedingsstoffen voor de zwangere muizen.
<p class = "jove_content"> De technieken waarbij dissectie van foetussen en microdissection van foetale hersenen worden zorgvuldig beschreven, omdat deze laatste kan een uitdaging zijn. Microdissection vereist een stereomicroscoop en ultra-fijn pincet. Stap-voor-stap procedures voor het ontleden van de foetale hersenen zijn visueel verstrekt. De foetale hersenen worden ontleed uit de basis van de primordium bulbus olfactorius aan de basis van de metencephalon.Voor het onderzoeken van apoptose, worden foetale hersenen eerst ingebed in gelatine met behulp van een schil-weg mal om hun snijden met een vibratome apparatuur te bevorderen. Foetale hersenen ingebed en gefixeerd in paraformaldehyde zijn gemakkelijk doorgesneden, en de vrij zwevende secties kunnen in superfrost plus dia's worden gemonteerd voor bepaling van apoptose of celdood.
TUNEL (TdT-gemedieerde dUTP Nick End Labeling; TdT: terminal deoxynucleotidyltransferase) assay werd gebruikt om celdood of apoptotische cellen te identificeren. Het is opmerkelijk dat apoptosis en celgemedieerde cytotoxiciteit wordt gekenmerkt door DNA fragmentatie. Dus de gevisualiseerde TUNEL-positieve cellen indicatief celdood of apoptotische cellen.
De experimentele ontwerpen hier vindt u informatie over het gebruik van een gevestigde vloeibaar dieet voor het bestuderen van de effecten van alcohol en de rol van de neurotrofe peptiden tijdens de zwangerschap in de foetale hersenen. Het gaat om het fokken en voederen zwangere muizen, microdissecting foetale hersenen, en het bepalen van apoptose. Samen kunnen deze visuele en tekstuele technieken een bron voor het onderzoeken van prenatale blootstelling aan schadelijke stoffen in de foetale hersenen zijn.
Introduction
Het doel van het hier beschreven experimentele methoden is om de neuroprotectieve effecten van trofische peptiden beoordelen in een foetale blootstelling model alcohol met behulp van verschillende technieken met fokkerij, voeding, microdissecting, en het opsporen van celdood. Werken vanuit ons laboratorium heeft betrekking op een vloeibaar dieet gemengd met alcohol als een model van matig alcohol drinken, die vergelijkbaar is met een menselijke paradigma drinken in termen van de hoeveelheid alcohol kan zijn geconsumeerd 1-5. Wij en anderen hebben drie peptide derivaten die neuroprotectieve tegen de schadelijke effecten van blootstelling foetaal alcohol geïdentificeerd. Onderzoeken naar blootstelling aan alcohol tijdens de embryonale stadia die dierlijke modellen kunnen leiden tot de identificatie van potentiële mechanismen van neuroprotectie en zorgen voor de ontwikkeling van de interventie procedures. Dit kan voldoende informatie over de neuroprotectieve effecten en verzwakking van de schadelijke effecten van blootstelling aan alcohol tijdens de zwangerschap verschaffen.
Mogelijke preventie van de effecten van prenatale alcohol kan de behandeling van zwangere muizen met peptiden die zijn getoond te zijn betrokken bij neuroprotectie in vitro en in vivo 6,7 1,2,4,8,9 betrekken. Onder deze peptiden, is SALLRSIPA, bekend als ADNF-9 of SAL, afgeleid van de activiteit-afhankelijke neurotrophic factor (ADNF) 7,10. Ander peptide met de sequentie NAPVSIPQ peptide, genoemd NAP, afgeleid van de activiteit-afhankelijke neuroprotectief eiwit (ADNP) 6,11, toonde een krachtige beschermende werking tegen oxidatieve stress in verband met blootstelling aan alcohol 12,13. Bovendien hebben we recent geïdentificeerde een nieuw peptide gesynthetiseerd, colivelin dat blijkt een belangrijke neuroprotectieve rol in de foetale alcoholblootstelling model 2. Colivelin is samengesteld uit ADNF-9 en AGA-(C8R) HNG17 (PAGASRLLLLTGEIDLP). Het belang van het gebruik van deze peptiden is dat ze de mogelijkheid omsteek de hersen-bloed barrière om de effecten van alcohol-geïnduceerde apoptose en de hersenen tekorten groei te voorkomen.
De experimentele methoden C57BL / 6 muizen voor het testen van de neuroprotectieve effecten tegen alcohol-geïnduceerde apoptose. Wij hebben een 2-uur-venster in plaats van 's nachts fokken om nauwkeurig inschatten van de embryonale dag 0 (E0), als het kan onthuld worden door detectie van een zaadcel plug en vaginaal uitstrijkje 1-5 aangenomen. We hebben gebruik gemaakt van een vloeibaar dieet met voeding buizen, omdat dit wordt beschouwd als gratis toegang in plaats van levering van alcohol door middel van sondevoeding route, die spanning kunnen veroorzaken aan zwangere muizen. Anderzijds kan microdissectie een uitdaging vanwege de zachtheid van het foetaal hersenweefsel, die zouden kunnen optreden bij het ontleden foetale hersens vroege embryonale stadia. Hier laten we zien gevisualiseerd technieken om te gaan met alle uitdagingen met betrekking microdissection. Aangezien de foetale hersenen snijden ook kan lastig zijn, hebben we aangenomeneen techniek die inhoudt dat het verankeren van de foetale hersenen in gelatine met behulp van peel-away inbedding mallen. We zijn succesvol geweest bij het terugdringen van de foetale hersenen in vrij zwevende secties 50 micrometer dik. Dit stelt ons in staat om wijzigingen van eiwitgehalte onderzoeken in foetale hersenen secties, waaronder de identificatie van celdood.
Protocol
Representative Results
Discussion
De en-technieken die in deze studie tonen de effecten van prenatale blootstelling aan alcohol in foetale hersenen en de rol van trofische peptiden in de preventie van deze effecten. Deze kunnen informatie over hoe u andere drugs van misbruik of andere giftige chemicaliën in de foetale hersenen tijdens de verschillende stadia zwangerschap bestuderen bieden.
Met betrekking tot het paradigma kweken, in sommige gevallen de detectie van het sperma stekker mogelijk niet waarneembaar. Op dit momen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd ondersteund door Award Aantal R21AA017735 (YS) van de National Institutes on Alcohol misbruik en alcoholisme. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteur en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van het National Institute on Alcohol Abuse en Alcoholisme of de National Institutes of Health. De auteur wil ook Charisse Montgomery bedanken voor het bewerken van dit manuscript.
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Superfrost Plus Slides | VWR | 48311-703 | |
| PAP PEN | Research Products Int. Corp. | 195506 | |
| 5-Plend Open Mailer | Heathrow Scientific, LLC | HS 15983G | |
| Peel away embedding molds | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| In situ cell death detection kit, POD | Roche Diagnostics, Inc | 11684817910 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14170-120 | |
| Gelatin Type A | FisherScientific | G8-500 | |
| Stereomicroscope | W. NUHSBAUM, Inc | Leica M60, KL 200 LED | |
| Micro-Vibratome | Leica, Inc | Leica VT 1000S | |
| Moria Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | 2 pairs |
| Graduate 30 ml feeding tubes | Dyets, Inc | 900012 | |
| Vitamin Mix | Bio-Serv. Inc. | F8031 | |
| Mineral Mix | Bio-Serv. Inc. | F8598 | |
| Maltose Dextrin | Bio-Serv. Inc. | 3650 | |
| Ethyl alcohol 190 Proof, 5 gallons | 111000190-SS05 | Pharmco-AAPER | |
| Upright microscope | W. NUHSBAUM, Inc | LEICA DM 4000 |
References
- Sari, Y. Activity-dependent neuroprotective protein-derived peptide, NAP, preventing alcohol-induced apoptosis in fetal brain of C57BL/6 mouse. Neuroscience. 158 (4), 1426-1435 (2009).
- Sari, Y., Chiba, T., Yamada, M., Rebec, G. V., Aiso, S. A novel peptide, colivelin, prevents alcohol-induced apoptosis in fetal brain of C57BL/6 mice: signaling pathway investigations. Neuroscience. 164 (4), 1653-1664 (2009).
- Sari, Y., Hammad, L. A., Saleh, M. M., Rebec, G. V., Mechref, Y. Alteration of selective neurotransmitters in fetal brains of prenatally alcohol-treated C57BL/6 mice: quantitative analysis using liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Int. J. Dev. Neurosci. 28 (3), 263-269 (2010).
- Sari, Y., Weedman, J. M., Ge, S. Activity-dependent neurotrophic factor-derived peptide prevents alcohol-induced apoptosis, in part, through Bcl2 and c-Jun N-terminal kinase signaling pathways in fetal brain of C57BL/6 mouse. Neuroscience. 202, 465-473 (2012).
- Sari, Y., Zhang, M., Mechref, Y. Differential expression of proteins in fetal brains of alcohol-treated prenatally C57BL/6 mice: a proteomic investigation. Electrophoresis. 31, 1-14 (2010).
- Bassan, M., Zamostiano, R., Davidson, A., Pinhasov, A., Giladi, E., Perl, O., Bassan, H., Blat, C., Gibney, G., Glazner, G., Brenneman, D. E., Gozes, I. Complete sequence of a novel protein containing a femtomolar-activity-dependent neuroprotective peptide. J. Neurochem. 72 (3), 1283-1293 (1999).
- Brenneman, D. E., Hauser, J., Neale, E., Rubinraut, S., Fridkin, M., Davidson, A., Gozes, I. Activity-dependent neurotrophic factor: structure-activity relationships of femtomolar-acting peptides. J. Pharmacol. Exp. Ther. 285 (2), 619-627 (1998).
- Spong, C. Y., Abebe, D. T., Gozes, I., Brenneman, D. E., Hill, J. M. Prevention of fetal demise and growth restriction in a mouse model of fetal alcohol syndrome. J. Pharmacol. Exp. Ther. 297 (2), 774-779 (2001).
- Sari, Y., Gozes, I. Brain deficits associated with fetal alcohol exposure may be protected, in part, by peptides derived from activity-dependent neurotrophic factor and activity-dependent neuroprotective protein. Brain Res. Brain Res. Rev. 52 (1), 107-118 (2006).
- Brenneman, D. E., Gozes, I. A femtomolar-acting neuroprotective peptide. J. Clin. Invest. 97 (10), 2299-2307 (1996).
- Zamostiano, R., Pinhasov, A., Gelber, E., Steingart, R. A., Seroussi, E., Giladi, E., Bassan, M., Wollman, Y., Eyre, H. J., Mulley, J. C., Brenneman, D. E., Gozes, I. Cloning and characterization of the human activity-dependent neuroprotective protein. J. Biol. Chem. 276 (1), 708-714 (2001).
- Offen, D., Sherki, Y., Melamed, E., Fridkin, M., Brenneman, D. E., Gozes, I. Vasoactive intestinal peptide (VIP) prevents neurotoxicity in neuronal cultures: relevance to neuroprotection in Parkinson’s disease. Brain Res. 854 (1-2), 257-262 (2000).
- Steingart, R. A., Solomon, B., Brenneman, D. E., Fridkin, M., Gozes, I. VIP and peptides related to activity-dependent neurotrophic factor protect PC12 cells against oxidative stress. J. Mol. Neurosci. 15 (3), 137-145 (2000).
