الطرق التجريبية لاختبار آثار الببتيد عصبية، ADNF-9، ضد موت الخلايا المبرمج الناجم عن الكحول أثناء فترة الحمل في C57BL / 6 الفئران
Summary
التصاميم التجريبية المقترحة هنا التركيز على دراسة آثار التعرض للكحول في موت الخلايا المبرمج وتطبيق الببتيد العصبي أثناء فترة الحمل في دماغ الجنين. يوصف وصفا مفصلا من تربية لجمع العقول الجنين. موصوفة تقنيات لتحديد الخلايا أيضا بالتفصيل.
Abstract
تصاميم تجريبية للتحقيق في الآثار المترتبة على التعرض للكحول قبل الولادة خلال المراحل الجنينية المبكرة في نمو دماغ الجنين تشكل تحديا. هذا يرجع في معظمه إلى صعوبة تسليخ مجهري من أدمغة الأجنة وباجتزاء من أجل تحديد الخلايا أفكارك التي يسببها التعرض قبل الولادة للكحول. التجارب الموصوفة هنا توفر تقنيات تصور من الفئران تربية لتحديد موت الخلايا في الجنين أنسجة المخ. استخدمت في هذه الدراسة C57BL / 6 الفئران كنموذج حيواني لدراسة التعرض للكحول الجنين ودور الببتيد الغذائية ضد الخلايا الناجم عن الكحول. يتكون تربية نافذة حصيرة 2 ساعة لتحديد المرحلة الدقيقة من عمر الجنين. وقد استخدم الجنين نموذج التعرض للكحول التي أنشئت في هذه الدراسة إلى تحديد آثار التعرض للكحول قبل الولادة في أدمغة الأجنة. وهذا ينطوي على حرية الوصول إلى الكحول أو الزوج التي تغذيها النظم الغذائية السائلة كمصدر وحيد من المواد المغذية للفئران الحوامل.
<p clasق = "jove_content"> موصوفة التقنيات التي تنطوي على تشريح الأجنة وتسليخ مجهري من أدمغة الأجنة بعناية، لأن هذا الأخير يمكن أن يكون تحديا. تسليخ مجهري يتطلب stereomicroscope ملقط وغاية في الدقة. يتم توفير إجراءات خطوة بخطوة لتشريح أدمغة الأجنة بصريا. يتم تشريح أدمغة الجنين من قاعدة البصلة الشمية منشم إلى قاعدة الدماغ التالي.للتحقيق في موت الخلايا المبرمج، هي جزء لا يتجزأ أدمغة الأجنة لأول مرة في الجيلاتين باستخدام قالب التقشير بعيدا لتسهيل باجتزاء مع جهاز vibratome. أدمغة الأجنة جزءا لا يتجزأ من وثابتة في بارافورمالدهيد هي مقطوع بسهولة، ويمكن تركيبه المقاطع التعويم الحر في superfrost الشرائح بالإضافة لتحديد الخلايا أو موت الخلية.
وقد استخدمت مقايسة لتحديد موت الخلية أو الخلايا أفكارك:؛ TUNEL (محطة deoxynucleotidyl ترانسفيراز TDT TDT بوساطة dUTP نيك نهاية وصفها). ومن الجدير بالذكر أن APوتتميز optosis والسمسة الخلية بوساطة من قبل تفتيت الحمض النووي. وهكذا، فإن إيجابية الخلايا TUNEL تصور تدل على موت الخلية أو الخلايا أفكارك.
التصاميم التجريبية هنا تقديم معلومات حول استخدام نظام غذائي السائلة التي أنشئت لدراسة آثار الكحول ودور الببتيد العصبي أثناء فترة الحمل في أدمغة الأجنة. وهذا ينطوي على تربية وتغذية الفئران الحوامل، microdissecting أدمغة الأجنة، وتحديد موت الخلايا المبرمج. معا، قد تكون هذه التقنيات البصرية والنصية مصدر للتحقيق التعرض قبل الولادة لعوامل ضارة في أدمغة الأجنة.
Introduction
الهدف من الطرق التجريبية وصفها هنا هو تقييم آثار اعصاب من الببتيدات الغذائية في نموذج التعرض للكحول الجنين باستخدام العديد من التقنيات التي تنطوي على تربية، تغذية، microdissecting، وكشف عن موت الخلايا. العمل من مختبرنا قد ينطوي على حمية سائلة مختلطة مع الكحول كنموذج للشرب الكحول المعتدل، والتي قد تكون مشابهة لنموذج الشرب الإنسان في فترة من كمية الكحول المستهلكة 1-5. وقد حددت نحن وآخرون ثلاثة المشتقات الببتيد التي هي اعصاب ضد الآثار الضارة للتعرض الكحول الجنينية. دراسات التحقيق التعرض للكحول خلال المراحل الجنينية باستخدام نماذج حيوانية قد يؤدي إلى تحديد الآليات المحتملة من العصبية وتسمح للوضع إجراءات التدخل. قد توفر هذه المعلومات وافرة حول الآثار اعصاب والتوهين من الآثار الضارة من التعرض للكحول خلال الحمل.
الوقاية الممكنة من آثار التعرض للكحول قبل الولادة قد تنطوي على معاملة الفئران الحوامل مع الببتيدات التي ثبت أن تشارك في الحماية العصبية في المختبر والمجراة 6،7 1،2،4،8،9. ومن بين هذه الببتيدات، SALLRSIPA، والمعروفة باسم ADNF-9 أو SAL، مشتق من النشاط التي تعتمد على عامل التغذية العصبية (ADNF) 7،10. الببتيد آخر مع تسلسل NAPVSIPQ الببتيد، برنامج العمل الوطني يطلق عليه، والمستمدة من البروتين اعصاب التي تعتمد على النشاط (ADNP) 6،11، أظهرت تأثير وقائي قوي ضد الاكسدة المرتبطة بالتعرض الكحول 12،13. وبالإضافة إلى ذلك، حددنا مؤخرا الجديدة توليفها الببتيد، colivelin الذي يظهر أن تلعب دورا رئيسيا في اعصاب الجنين الكحول نموذج التعرض 2. وتتألف Colivelin من ADNF-9 وAGA-(C8R) HNG17 (PAGASRLLLLTGEIDLP). أهمية استخدام هذه الببتيدات هو أن لديهم القدرة علىعبور حاجز الدم في الدماغ لمنع آثار موت الخلايا المبرمج الناجم عن الكحول والعجز نمو الدماغ.
الطرق التجريبية المستخدمة C57BL / 6 الفئران لاختبار آثار اعصاب ضد الخلايا الناجم عن الكحول. اعتمدنا نافذة 2 ساعة بدلا من تربية ليلة وضحاها من أجل تقدير دقيق ليوم الجنينية 0 (E0)، كما أنه يمكن أن يكشف عنها الكشف عن المكونات الحيوانات المنوية ومسحة مهبلية 1-5. وقد استخدمنا نظام غذائي السائل مع أنابيب التغذية، لأن هذا يعتبر وصول الحرة بدلا من تقديم الكحول من خلال مسار أنبوب تغذية، والتي ربما تتسبب في الضغط على الفئران الحوامل. من ناحية أخرى، تسليخ مجهري يمكن أن يكون تحديا بسبب ليونة الأنسجة دماغ الجنين، التي قد تواجهها عند تشريح أدمغة الأجنة في المراحل الجنينية المبكرة. هنا، وتبين لنا تقنيات تصور للتعامل مع جميع التحديات التي تنطوي تسليخ مجهري. وعلاوة على ذلك، منذ باجتزاء دماغ الجنين ويمكن أيضا أن يكون تحديا، الذي اعتمدناهالاسلوب الذي ينطوي على تضمين أدمغة الأجنة في الجيلاتين باستخدام قشر بعيدا تضمين القوالب. وقد نجحنا في خفض أدمغة الأجنة في أقسام التعويم الحر في 50 ميكرون سماكة. وهذا يسمح لنا لتحقيق أي تعديلات من محتوى البروتين في أقسام دماغ الجنين، بما في ذلك تحديد موت الخلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
المنهجية والتكنولوجيا المقدمة في هذه الدراسة تثبت آثار التعرض قبل الولادة للكحول في أدمغة الأجنة ودور الببتيد التغذية في الوقاية من هذه الآثار. قد توفر هذه المعلومات على كيفية دراسة أدوية أخرى من سوء المعاملة أو المواد الكيميائية السامة الأخرى في أدمغة الجنين خلال …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا المشروع البحثي من قبل جائزة عدد R21AA017735 (يس) من المعاهد الوطنية لتعاطي الكحول والإدمان على الكحول. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكاتب ولا تعبر بالضرورة عن وجهة النظر الرسمية للمعهد الوطني لتعاطي الكحول والإدمان على الكحول أو المعاهد الوطنية للصحة. ويود الكاتب أيضا أن أشكر تشاريس مونتغمري لتحرير هذه المخطوطة.
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Superfrost Plus Slides | VWR | 48311-703 | |
| PAP PEN | Research Products Int. Corp. | 195506 | |
| 5-Plend Open Mailer | Heathrow Scientific, LLC | HS 15983G | |
| Peel away embedding molds | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| In situ cell death detection kit, POD | Roche Diagnostics, Inc | 11684817910 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14170-120 | |
| Gelatin Type A | FisherScientific | G8-500 | |
| Stereomicroscope | W. NUHSBAUM, Inc | Leica M60, KL 200 LED | |
| Micro-Vibratome | Leica, Inc | Leica VT 1000S | |
| Moria Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | 2 pairs |
| Graduate 30 ml feeding tubes | Dyets, Inc | 900012 | |
| Vitamin Mix | Bio-Serv. Inc. | F8031 | |
| Mineral Mix | Bio-Serv. Inc. | F8598 | |
| Maltose Dextrin | Bio-Serv. Inc. | 3650 | |
| Ethyl alcohol 190 Proof, 5 gallons | 111000190-SS05 | Pharmco-AAPER | |
| Upright microscope | W. NUHSBAUM, Inc | LEICA DM 4000 |
References
- Sari, Y. Activity-dependent neuroprotective protein-derived peptide, NAP, preventing alcohol-induced apoptosis in fetal brain of C57BL/6 mouse. Neuroscience. 158 (4), 1426-1435 (2009).
- Sari, Y., Chiba, T., Yamada, M., Rebec, G. V., Aiso, S. A novel peptide, colivelin, prevents alcohol-induced apoptosis in fetal brain of C57BL/6 mice: signaling pathway investigations. Neuroscience. 164 (4), 1653-1664 (2009).
- Sari, Y., Hammad, L. A., Saleh, M. M., Rebec, G. V., Mechref, Y. Alteration of selective neurotransmitters in fetal brains of prenatally alcohol-treated C57BL/6 mice: quantitative analysis using liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Int. J. Dev. Neurosci. 28 (3), 263-269 (2010).
- Sari, Y., Weedman, J. M., Ge, S. Activity-dependent neurotrophic factor-derived peptide prevents alcohol-induced apoptosis, in part, through Bcl2 and c-Jun N-terminal kinase signaling pathways in fetal brain of C57BL/6 mouse. Neuroscience. 202, 465-473 (2012).
- Sari, Y., Zhang, M., Mechref, Y. Differential expression of proteins in fetal brains of alcohol-treated prenatally C57BL/6 mice: a proteomic investigation. Electrophoresis. 31, 1-14 (2010).
- Bassan, M., Zamostiano, R., Davidson, A., Pinhasov, A., Giladi, E., Perl, O., Bassan, H., Blat, C., Gibney, G., Glazner, G., Brenneman, D. E., Gozes, I. Complete sequence of a novel protein containing a femtomolar-activity-dependent neuroprotective peptide. J. Neurochem. 72 (3), 1283-1293 (1999).
- Brenneman, D. E., Hauser, J., Neale, E., Rubinraut, S., Fridkin, M., Davidson, A., Gozes, I. Activity-dependent neurotrophic factor: structure-activity relationships of femtomolar-acting peptides. J. Pharmacol. Exp. Ther. 285 (2), 619-627 (1998).
- Spong, C. Y., Abebe, D. T., Gozes, I., Brenneman, D. E., Hill, J. M. Prevention of fetal demise and growth restriction in a mouse model of fetal alcohol syndrome. J. Pharmacol. Exp. Ther. 297 (2), 774-779 (2001).
- Sari, Y., Gozes, I. Brain deficits associated with fetal alcohol exposure may be protected, in part, by peptides derived from activity-dependent neurotrophic factor and activity-dependent neuroprotective protein. Brain Res. Brain Res. Rev. 52 (1), 107-118 (2006).
- Brenneman, D. E., Gozes, I. A femtomolar-acting neuroprotective peptide. J. Clin. Invest. 97 (10), 2299-2307 (1996).
- Zamostiano, R., Pinhasov, A., Gelber, E., Steingart, R. A., Seroussi, E., Giladi, E., Bassan, M., Wollman, Y., Eyre, H. J., Mulley, J. C., Brenneman, D. E., Gozes, I. Cloning and characterization of the human activity-dependent neuroprotective protein. J. Biol. Chem. 276 (1), 708-714 (2001).
- Offen, D., Sherki, Y., Melamed, E., Fridkin, M., Brenneman, D. E., Gozes, I. Vasoactive intestinal peptide (VIP) prevents neurotoxicity in neuronal cultures: relevance to neuroprotection in Parkinson’s disease. Brain Res. 854 (1-2), 257-262 (2000).
- Steingart, R. A., Solomon, B., Brenneman, D. E., Fridkin, M., Gozes, I. VIP and peptides related to activity-dependent neurotrophic factor protect PC12 cells against oxidative stress. J. Mol. Neurosci. 15 (3), 137-145 (2000).
