Alkole bağlı C57BL Hamilelik sırasında Apoptoz / 6 Fare Karşı, Nörotrofik Peptit, ADNF-9 Etkilerinin Test için Deneysel Yöntemler
Summary
Deneysel tasarımlar fetal beyin gebelik sırasında apoptoz ve nörotrofik peptid uygulama alkol maruz kalmanın etkilerini araştırmak burada odaklanmak önerdi. Üreme fetal beyin koleksiyonuna ayrıntılı bir açıklama açıklanmıştır. Apoptozun belirlenmesi için teknikler de detaylı bir şekilde tarif edilmektedir.
Abstract
Fetal beyin gelişimi erken embriyonik aşamalarında doğum öncesi alkol maruz kalma etkilerini araştırmak için deneysel tasarımlar zorlu. Bu daha çok fetal beyin ve alkol prenatal maruz kalma sonucu apoptotik hücrelerin belirlenmesi için kendi kesit bir mikrodiseksiyon zorluğu kaynaklanmaktadır. Deneyler fetal beyin dokusunda hücre ölümü kimlik yetiştiriciliği farelerden alınan görsel teknikler sağlar tanımlanmıştır. Bu çalışma, C57BL / kullanılan alkolün indüklediği apoptoza karşı fetal alkol maruz kalma ve trofik peptid rolü üzerinde çalışılması için hayvan modeli olarak, 6 farenin. Üreme embriyonik yaş tam evresini belirlemek için bir 2 saatlik paspas pencereden oluşur. Kurulu bir fetal alkol maruz kalma modeli fetal beyinlerinde prenatal alkol maruz kalma etkilerini belirlemek için bu çalışmada kullanılmıştır. Bu hamile fareler için besin tek kaynağı olarak alkol ya da çift-beslenen sıvı diyetler ücretsiz erişim içerir.
<p class = "jove_content"> ikinci zor olabilir çünkü fetus ve fetal beyin Mikrodisseksiyon diseksiyonu içeren teknikleri, dikkatli bir şekilde açıklanmıştır. Mikrodisseksiyon bir stereomikroskopta ve ultra-ince forseps gerektirir. Fetal beyin diseksiyon için adım adım işlemleri görsel olarak verilmektedir. Fetal beyin primordium koku ampul tabanından metencephalon en tabanına disseke edilir.Apoptoz soruşturma için, fetal beyin ilk vibratome aparatı ile kesit kolaylaştırmak için bir peel-away kalıp kullanarak jelatin gömülür. Paraformaldehit gömülü ve sabit fetal beyinleri kolayca kesitli ve serbest yüzen bölümleri apoptosis ya da hücre ölümünün belirlenmesi için Superfrost Plus, slaytlar monte edilebilir.
TÜNEL (TdT-aracılı dUTP Nick uç etiketleme; TdT: terminal deoksinükleotidil transferaz) tahlili hücre ölümü ya da apoptoz hücreleri tanımlamak için kullanılmıştır. Bu dikkat çekicidir ki apoptosis ve hücre-aracılı sitotoksisite, DNA parçalanması ile karakterize edilir. Bu nedenle, görsel TÜNEL-pozitif hücrelerde hücre ölümü veya apoptotik hücrelerin bir göstergesidir.
Burada deneysel tasarımlar fetal beyinlerinde gebelik sırasında alkol etkilerini araştırmak için kurulmuş bir sıvı diyet kullanımı hakkında bilgi ve nörotrofik peptidlerin rolü sağlar. Bu üreme ve hamile fareler beslenme, fetal beyin Microdissecting ve apoptoz belirlenmesi içerir. Birlikte, bu görsel ve metinsel teknikleri fetal beyinlerinde zararlı ajanların prenatal maruz araştırmak için bir kaynak olabilir.
Introduction
Burada açıklanan deneysel yöntemlerin amacı, beslenme Microdissecting ve hücre ölümü tespit, ıslah içeren çeşitli teknikler kullanarak fetal alkol maruz modelinde trofik peptidlerin nöroprotektif etkilerini değerlendirmektir. Laboratuvarımızda çalışmak alkol miktarı vadede bir insan içme paradigma benzer olabilir ılımlı alkol içme, bir model olarak alkol ile karışık bir sıvı diyet yer vardır 1-5 tüketilen. Biz ve diğerleri fetal alkol maruz kalmanın zararlı etkilerine karşı nöroprotektif üç peptit türevleri belirledik. Hayvan modelleri kullanarak embriyonik aşamalarında alkol maruz araştıran çalışmalar nöro potansiyel mekanizmalarının belirlenmesi yol ve müdahale prosedürlerinin geliştirilmesi için izin verebilir. Bu hamilelik sırasında alkol maruz kalmanın zararlı etkileri nöroprotektif etkileri ve zayıflama hakkında geniş bilgi verebilir.
Prenatal alkol maruz kalma etkileri mümkün önlenmesi in vitro ve in vivo 6,7 1,2,4,8,9 nöroproteksiyon dahil olmak gösterilmiştir peptitler ile gebe farelerin tedavisinde içerebilir. Bu peptidler arasında, ADNF-9 ya da SAL olarak bilinen SALLRSIPA, aktivite bağımlı nörotrofik faktör (ADNF) 7,10 türetilmiştir. Dizisi NAPVSIPQ peptid olarak adlandırılan NAP, başka bir peptit aktivite bağımlı nöroprotektif protein (ADNP) 6,11 elde edilen, alkol maruz kalma 12,13 ile ilişkili oksidatif strese karşı güçlü bir koruyucu etki göstermiştir. Buna ek olarak, son zamanlarda fetal alkol maruz modeli 2 önemli bir nöroprotektif rol oynadığı yeni bir sentez peptit, colivelin belirledik. Colivelin ADNF-9 ve AGA-(C8R) HNG17 (PAGASRLLLLTGEIDLP) oluşmaktadır. Bu peptidlerin kullanımının önemi onlar yeteneğine sahip olmasıdıralkole bağlı apoptoz ve beyin gelişimi açıklarının etkilerini önlemek için beyin-kan bariyeri çapraz.
Deneysel yöntem alkol kaynaklı apoptoz karşı nöro-koruyucu etkisi test etmek için C57BL / 6 fareleri kullanılmıştır. Biz bir sperm fiş ve vajinal smear 1-5 tespiti ile ortaya gibi doğru, embriyonik gün 0 (E0) tahmin etmek için yerine bir gecede ıslah bir 2 saatlik pencere benimsemiştir. Bu hamile farelere stres neden olabilir gavaj yolu, ile yerine alkol teslimat ücretsiz kabul edilir gibi, besleme tüpleri ile bir sıvı diyet kullandık. Öte yandan, mikrodiseksiyon erken evrelerinde fetal beyinleri kesme karşılaşılan olabilir fetal beyin dokusunun, yumuşak olması nedeniyle zor olabilir. Burada, mikrodiseksiyon ile ilgili tüm zorlukları ile başa çıkmak için görsel teknikleri göstermektedir. Ayrıca, fetal beyin kesit de zor olabilir çünkü, benimsediğimizjelatin gömme peel-away kullanarak kalıplara fetal beyin gömme içeren bir tekniktir. Biz 50 mikron kalınlığında serbest dalgalı bölümlerde fetal beyin kesme başarılı olmuştur. Bu bizim hücre ölümü belirlenmesi de dahil olmak üzere, fetal beyin bölümlerini içeriği protein herhangi bir değişiklik araştırmak için izin verir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada yer alan yöntemleri ve teknolojisi Prenatal beyinlerinde alkole maruz kalma ve bu etkilerin önlenmesi trofik peptidlerin rolü etkilerini göstermektedir. Bu farklı gebelik dönemlerinde istismar veya fetal beyinlerinde diğer zehirli kimyasal maddelerin diğer ilaçlar çalışma hakkında bilgi sağlayabilir.
Üreme paradigması ile ilgili olarak, bazı durumlarda, sperm fişin tespit gözlemlenmeyen olabilir. Bu noktada, bu mümkün sperm olumlu algılama sağlayabilir,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma projesi Alkol İstismarı ve Alkolizm Ulusal Enstitüsü Ödülü sayısı R21AA017735 (YS) tarafından desteklenmiştir. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Alkol İstismarı ve Alkolizm veya Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Enstitüsü resmi görüşlerini temsil etmemektedir. Yazar ayrıca, bu yazının düzenleme için Charisse Montgomery teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Superfrost Plus Slides | VWR | 48311-703 | |
| PAP PEN | Research Products Int. Corp. | 195506 | |
| 5-Plend Open Mailer | Heathrow Scientific, LLC | HS 15983G | |
| Peel away embedding molds | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| In situ cell death detection kit, POD | Roche Diagnostics, Inc | 11684817910 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14170-120 | |
| Gelatin Type A | FisherScientific | G8-500 | |
| Stereomicroscope | W. NUHSBAUM, Inc | Leica M60, KL 200 LED | |
| Micro-Vibratome | Leica, Inc | Leica VT 1000S | |
| Moria Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | 2 pairs |
| Graduate 30 ml feeding tubes | Dyets, Inc | 900012 | |
| Vitamin Mix | Bio-Serv. Inc. | F8031 | |
| Mineral Mix | Bio-Serv. Inc. | F8598 | |
| Maltose Dextrin | Bio-Serv. Inc. | 3650 | |
| Ethyl alcohol 190 Proof, 5 gallons | 111000190-SS05 | Pharmco-AAPER | |
| Upright microscope | W. NUHSBAUM, Inc | LEICA DM 4000 |
References
- Sari, Y. Activity-dependent neuroprotective protein-derived peptide, NAP, preventing alcohol-induced apoptosis in fetal brain of C57BL/6 mouse. Neuroscience. 158 (4), 1426-1435 (2009).
- Sari, Y., Chiba, T., Yamada, M., Rebec, G. V., Aiso, S. A novel peptide, colivelin, prevents alcohol-induced apoptosis in fetal brain of C57BL/6 mice: signaling pathway investigations. Neuroscience. 164 (4), 1653-1664 (2009).
- Sari, Y., Hammad, L. A., Saleh, M. M., Rebec, G. V., Mechref, Y. Alteration of selective neurotransmitters in fetal brains of prenatally alcohol-treated C57BL/6 mice: quantitative analysis using liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Int. J. Dev. Neurosci. 28 (3), 263-269 (2010).
- Sari, Y., Weedman, J. M., Ge, S. Activity-dependent neurotrophic factor-derived peptide prevents alcohol-induced apoptosis, in part, through Bcl2 and c-Jun N-terminal kinase signaling pathways in fetal brain of C57BL/6 mouse. Neuroscience. 202, 465-473 (2012).
- Sari, Y., Zhang, M., Mechref, Y. Differential expression of proteins in fetal brains of alcohol-treated prenatally C57BL/6 mice: a proteomic investigation. Electrophoresis. 31, 1-14 (2010).
- Bassan, M., Zamostiano, R., Davidson, A., Pinhasov, A., Giladi, E., Perl, O., Bassan, H., Blat, C., Gibney, G., Glazner, G., Brenneman, D. E., Gozes, I. Complete sequence of a novel protein containing a femtomolar-activity-dependent neuroprotective peptide. J. Neurochem. 72 (3), 1283-1293 (1999).
- Brenneman, D. E., Hauser, J., Neale, E., Rubinraut, S., Fridkin, M., Davidson, A., Gozes, I. Activity-dependent neurotrophic factor: structure-activity relationships of femtomolar-acting peptides. J. Pharmacol. Exp. Ther. 285 (2), 619-627 (1998).
- Spong, C. Y., Abebe, D. T., Gozes, I., Brenneman, D. E., Hill, J. M. Prevention of fetal demise and growth restriction in a mouse model of fetal alcohol syndrome. J. Pharmacol. Exp. Ther. 297 (2), 774-779 (2001).
- Sari, Y., Gozes, I. Brain deficits associated with fetal alcohol exposure may be protected, in part, by peptides derived from activity-dependent neurotrophic factor and activity-dependent neuroprotective protein. Brain Res. Brain Res. Rev. 52 (1), 107-118 (2006).
- Brenneman, D. E., Gozes, I. A femtomolar-acting neuroprotective peptide. J. Clin. Invest. 97 (10), 2299-2307 (1996).
- Zamostiano, R., Pinhasov, A., Gelber, E., Steingart, R. A., Seroussi, E., Giladi, E., Bassan, M., Wollman, Y., Eyre, H. J., Mulley, J. C., Brenneman, D. E., Gozes, I. Cloning and characterization of the human activity-dependent neuroprotective protein. J. Biol. Chem. 276 (1), 708-714 (2001).
- Offen, D., Sherki, Y., Melamed, E., Fridkin, M., Brenneman, D. E., Gozes, I. Vasoactive intestinal peptide (VIP) prevents neurotoxicity in neuronal cultures: relevance to neuroprotection in Parkinson’s disease. Brain Res. 854 (1-2), 257-262 (2000).
- Steingart, R. A., Solomon, B., Brenneman, D. E., Fridkin, M., Gozes, I. VIP and peptides related to activity-dependent neurotrophic factor protect PC12 cells against oxidative stress. J. Mol. Neurosci. 15 (3), 137-145 (2000).
