Farelerde Kontrollü Servikal yırtığı Sakatlık
Summary
Bir tekrarlanabilir oluşturmak için bir roman tekniği<em> In vivo</emFare servikal spinal kord laserasyon hasarı> modeli açıklanmıştır. Bu teknik ± 0.01 mm bir hassasiyetle salınan bir bıçak kullanarak omurilik servikal yönleri ve yırtık tespit ile omurga stabilizasyon dayanmaktadır.
Abstract
Genetiği değiştirilmiş farelerin kullanımı böyle bir omurilik yaralanması (SKY) gibi çeşitli nörolojik bozukluklar altında yatan moleküler mekanizmaları anlayışımız artırır. SCI bir laserasyon modeli üretmek için kullanılan serbest manuel kontrol genellikle ezmeyin veya kontüzyon bileşen ve bu nedenle, yeni bir teknik geliştirildi ile ilgili tutarsız yaralanmaları oluşturur. Servikal laserasyon SCI Bizim modeli) vertebra faset sabitleme, 2 ile) gelişmiş omurilik maruz servikal vertebra stabilizasyonu 1 dahil ederek serbest yöntemi ile doğal sorunların ortadan kalktığını ve 3) omurilik bir tekrarlanabilir laserasyon yaratılması salınan bir bıçak kullanarak ilişkili kontüzyon olmadan derinlemesine ± 0.01 mm doğruluk. Böyle bir neşter ya da makas serbest kullanımı gibi bir SCI laserasyon oluşturma standart yöntemlerle karşılaştırıldığında, bizim yöntem tutarlı bir lezyon üretti. Bu yöntem corticosp bir aksonal rejenerasyon çalışmaları için yararlıdırinal, rubrospinal ve dorsal artan yolları.
Introduction
Genetik olarak değiştirilmiş farelerin durumu SCI mekanizmalarında rol oynayan spesifik genlerin etkilerini belirlemek için güçlü bir araçtır. Yırtığı SCI bu yaralanma 8 sonra etkili bir tedavi sağlayabilir terapötik ajanlar veya moleküller incelemek için kullanılan önemli bir modeldir. Farelerde laserasyon yaralanma oluşturulması sırasında spinöz süreçleri Tespit nedeniyle spinal fiksasyon 5,11 bakımı ile ilgili ince ve kırılgan spinöz süreçleri kavrama zorluk için kesin olmayan. Sadece 0.2 mm (fare omurilik çapının% 10) laserasyon derinliği değişkenlik verilerin yanıltıcı yorumlanması neden olur. Omurilik kesisi lezyonun doğası ve kapsamı tam 10 tanımlanmalıdır. Bu sorunu gidermek için, biz vertebra stabilizasyonu oluşan yeni bir teknik geliştirdi ve Louisville Sakatlık Sistemi Aparatı bağlı fabrikasyon bıçak kullanmış (LISA) bir kesi SCI 7,14 üretmek. Bu yaralanma laserasyon sürecinde doku deformasyon kaçınılması keskin salınan bıçak kullanılarak oluşturuldu. Laserasyon derinliği laserasyon derinliğini kontrol mikro-sürücüleri kullanarak 0.01 mm doğrulukla hassas oldu. Kesme bıçakları istenen laserasyon kontur 9 oluşturmak için belirli şekil ve genişlikleri için-özel yapılır. Biz, 1), servikal omurga maruz kalma, 2'nin yöntemi) karşılıklı bir yönüyle sabitleme cihazı kullanılarak omurga sabitleme tekniği ve titreşen bir bıçak kullanarak bir yırtılma servikal yaralanma 3) oluşturulmasını göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Omuriliğe laserasyon yaralanmaları önce vertebra stabilizasyonu spinöz süreçleri tespit ile elde edilmiştir. Fare T1 ile C3 oynak kısa servikal spinöz süreçlerine kelepçeler servikal lordoz ve eki hem etkili omurga stabilizasyon önlemek. Ayrıca, manuel kontrol lezyonun 6 derinliği değişkenlik oluşturur önemli doku deformasyon neden altında kullanılan bir jilet veya microscissors kullanın. Bu özel yolların aksonal rejenerasyon incelenmiştir özellikle verilerin yanlış yol açabilir. Dorsal kortikospinal yolu tamamen lezyon sırasında nakledilmiştir değildi Örneğin, bağışladı dorsal kortikospinal akson yeniden akson olarak yanlış olabilir. Bu sorunlar tek bir seviyesi ve omuriliğin kesin lezyon de yönleriyle için tespit ile bir omurga stabilizasyon cihazı kullanılarak aşılabilir. Buna ek olarak, ah kullanılaraküksek frekans salınan bıçak komşu omurilik kırma veya contusing olmadan keskin bir kesi oluşturur. Bu yöntem, farenin 6 toraks omurilik laserasyon üretimi için müteakip değişiklikler ile birlikte, 9,12,14 sıçanlarda omurilik yaralanması yaralanmaları üretmek için kullanılmıştır. Mevcut iletişim olarak, fare güvenilir servikal laserasyon lezyonların oluşturma yöntemi açıklanmaktadır.
Omurilik ön-arka çapı fare <2 mm olduğu ölçüde, laserasyon lezyonun kesin derinliklerinde güvenilir bir deneysel model oluşturmada önemlidir. Lezyon derinliği minimal değişkenlik önemli ölçüde akson rejenerasyonu yanı sıra hacim ve davranış çalışmaları değerlendirmek deney sonuçları değiştirecektir. Biz kesme bıçağı yerini kontrol etmek için yüksek hassasiyetli mikro-sürücüler kullanılır, çünkü bu yöntemi kullanarak lezyon derinlik hassasiyeti ± 0.01 mm'dir. Bu yöntem, en tutarsızlık azalttıbir yırtık SCI yaratma diğer modellerinde herent. Bu yöntem, kortikospinal sistem, rubrospinal sistem ve dorsal artan sistemi gibi omurilik dorsal yarısında bulunan uzun omurilik yolakların aksonal rejenerasyon inceleyerek özellikle yararlıdır. Bu yöntemle, bu lif yolları tamamen olması ve güvenilir transeksiyon olabilir. Bu bağlamda, veri yorumlama hataları böylece SCI üzerinde deneysel çalışmalar raporlama güvenilirliğini geliştirerek, en aza indirilir.
Özetle, biz fare servikal spinal kord yaralanması yırtık in vivo modelinde bir tekrarlanabilir oluşturmak için yeni bir teknik tarif var. Bu teknik bir salınım bıçak kullanarak omurilik servikal yönleri ve yırtık tespit ile omurga stabilizasyon dayanmaktadır. Fareler 6 bir dorsal torasik omurilik kesisi modelinde Bu yöntemi kullanarak, biz laserasyon derinliği, histoloji ve arasında sıkı bir korelasyon gösterdidavranış kurtarma. Böyle bir teknik, ayrıca çok sayıda diğer laboratuar 2,12 ile güvenilir olduğu bulunmuştur.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu cihazın geliştirilmesi LISA Co, Louisville, Kentucky tarafından desteklenmiştir. Ayrıca Norton Sağlık, Louisville, CBS için KY ve NIH NS050243, NS052290 ve XMX için NS059622 devam eden desteği kabul.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Mice vertebral stabilizer | Louisville Impactor System | Stabilize and expose the cervical vertebra | |
| LISA vibraknife | Louisville Impactor System | Produce the laceration injury of the cervical spinal cord | |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15013-12 | Skin and trapezius muscle incision |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15023-10 | Separate muscles from the laminae |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15002-08 | Incision of dura |
| Graefe forceps | Fine Science Tools (USA) | 11154-10 | Retract skin |
| Dumont #7 forceps | Fine Science Tools (USA) | 11274-20 | Muscle retraction (tip modified)(Fig. A) |
| Dumont SS forceps | Fine Science Tools (USA) | 11203-25 | Fixation of vertebra (tip modified )(Fig.B) |
| 30G needle | Becton Dickenson | 305106 | Create a dural opening |
| 6-0 suture | Ethicon | 8806H | Close muscle and fascial layers |
| wound clip | Fine Science Tools (USA) | 12031-07 | Skin closure |
| Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | 90710-10G | Anesthetic agent |
Louisville Impactor System, Inc, 210 E. Gray St., Suite 1102, Louisville, KY 40202, (502) 629-5510, E-mail: cbshields1@gmail.com Fine Science Tools (USA), Inc, 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139, (800) 521-2109, E-mail: info@finescience.com Becton Dickenson, 1 Becton Drive, Franklin Lakes, NJ USA 07417, (201) 847-6800 Ethicon, Route 22 West, Somerville, NJ 08876 1-877-ETHICON Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA, 63178 (314) 771-5765, E-mail: cssorders@sial.com |
|||
| Figure A is the modified Dumont #7 forceps; B is the modified Dumont SS forceps. |
References
- Blackmore, M., Letourneau, P. C. Changes within maturing neurons limit axonal regeneration in the developing spinal cord. J. Neurobiol. 66 (4), 348 (2006).
- Blackmore, M. G., et al. Kruppel-like Factor 7 engineered for transcriptional activation promotes axon regeneration in the adult corticospinal tract. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 109 (19), 7517 (2012).
- Carbajal, K. S., et al. Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus. J. Vis. Exp. (53), e2834 (2011).
- Duhamel, G. Mouse lumbar and cervical spinal cord blood flow measurements by arterial spin labeling: sensitivity optimization and first application. Magn. Reson. Med. 62 (2), 430 (2009).
- Hermanns, S., Reiprich, P., Muller, H. W. A reliable method to reduce collagen scar formation in the lesioned rat spinal cord. J. Neurosci. Methods. 110 (1-2), 141 (2001).
- Hill, R. L. Anatomic and functional outcomes following a precise, graded, dorsal laceration spinal cord injury in C57BL/6 mice. J. Neurotrauma. 26 (1), 1 (2009).
- Iannotti, C. Dural repair reduces connective tissue scar invasion and cystic cavity formation after acute spinal cord laceration injury in adult rats. J. Neurotrauma. 23 (6), 853 (2006).
- Inman, D., Guth, L., Steward, O. Genetic influences on secondary degeneration and wound healing following spinal cord injury in various strains of mice. J. Comp Neurol. 451 (3), 225 (2002).
- Onifer, S. M., et al. Adult rat forelimb dysfunction after dorsal cervical spinal cord injury. Exp. Neurol. 192 (1), 25 (2005).
- Ramer, M. S., Harper, G. P., Bradbury, E. J. Progress in spinal cord research – a refined strategy for the International Spinal Research Trust. Spinal Cord. 38 (8), 449 (2000).
- Seitz, A., Aglow, E., Heber-Katz, E. Recovery from spinal cord injury: a new transection model in the C57Bl/6 mouse. J. Neurosci. Res. 67 (3), 337 (2002).
- Sivasankaran, R., et al. PKC mediates inhibitory effects of myelin and chondroitin sulfate proteoglycans on axonal regeneration. Nat. Neurosci. 7 (3), 261 (2004).
- Yu, P., et al. Inhibitor of DNA binding 2 promotes sensory axonal growth after SCI. Exp. Neurol. 231 (1), 38 (2011).
- Zhang, Y. P. Dural closure, cord approximation, and clot removal: enhancement of tissue sparing in a novel laceration spinal cord injury model. J. Neurosurg. 100, 343 (2004).
