Gecontroleerde Cervicale Laceration Letsel in Muizen
Summary
Een nieuwe techniek om een reproduceerbare creëren<em> In vivo</em> Model van cervicale ruggenmerg verwonding verwonding in de muis wordt beschreven. Deze techniek is gebaseerd op de rug stabilisatie door fixatie van de cervicale facetten en scheuren van het ruggenmerg met een oscillerend mes met een nauwkeurigheid van ± 0,01 mm.
Abstract
Gebruik van genetisch gemodificeerde muizen verbetert ons begrip van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan verschillende neurologische aandoeningen zoals een dwarslaesie (SCI). Freehand handbediening gebruikt om een scheur model van SCI produceren creëert inconsistent blessures vaak geassocieerd met een crush of kneuzing component en daarom werd een nieuwe techniek ontwikkeld. Ons model van cervicale laceratie SCI heeft inherente problemen met de vrije hand methode opgelost door het opnemen van 1) cervicale wervelkolom stabilisatie door wervel facet fixatie, 2) verbeterde spinal cord blootstelling, en 3) de oprichting van een reproduceerbare scheur van het ruggenmerg met behulp van een oscillerende mes met een nauwkeurigheid van ± 0,01 mm in de diepte zonder bijbehorende kneuzing. Vergeleken met de standaard methoden voor het maken van een scheur SCI zoals vrije hand gebruik van een scalpel of schaar is onze werkwijze produceerde een consistente laesie. Deze methode is nuttig voor studies op axonale regeneratie van corticospinal, rubrospinale, en dorsale oplopende traktaten.
Introduction
De beschikbaarheid van genetisch gemodificeerde muizen is een krachtig hulpmiddel om de effecten van bepaalde genen die een rol spelen bij de mechanismen van SCI identificeren. Laceration SCI is een belangrijk model gebruikt om therapeutische middelen of moleculen die een effectieve behandeling kan bieden na deze blessure 8 onderzoeken. Fixatie van de doornuitsteeksels tijdens het maken van de scheur letsel bij muizen is onnauwkeurig te wijten aan de moeilijkheden om de dunne en kwetsbare doornuitsteeksels betrokken bij het handhaven van spinale fixatie 5,11. Variabiliteit in de diepte van de scheur van slechts 0,2 mm (10% van de diameter van de muis ruggenmerg) veroorzaakt misleidende interpretatie van gegevens. De aard en omvang van het ruggenmerg scheur laesie moet exact worden gedefinieerd 10. Om deze uitdaging aan te pakken, hebben we een nieuwe techniek die bestaat uit vertebrale stabilisatie ontwikkeld en gebruikt gefabriceerd bladen bevestigd aan de Louisville Injury System Apparatus (LISA) een scheur SCI 7,14 produceren. Deze blessure is gemaakt met behulp van een scherpe oscillerend mes dat weefsel vervorming vermeden tijdens de scheur proces. De diepte van de scheur was precies met een nauwkeurigheid van 0,01 mm met behulp van micro-drivers die de scheur diepte te controleren. Snijbladen zijn op maat gemaakt voor de specifieke vormen en breedtes om de gewenste scheur creëren contour 9. We demonstreren 1) de methode van cervicale wervelkolom blootstelling, 2) de techniek van het wervellichaam stabilisatie met behulp van een bilaterale facet fixatie-apparaat, en 3) het creëren van een cervicale scheur letsel met behulp van een vibrerende mes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vertebrale stabilisatie vóór scheuren verwondingen aan het ruggenmerg werd verkregen door fixatie van de doornuitsteeksels. Zowel de cervicale wervelkolom lordotic curve en bevestiging van klemmen om de broze korte baarmoederhals doornuitsteeksels C3 tot T1 in de muis te voorkomen effectieve wervelkolom stabiliseren. Bovendien wordt het gebruik van een scheermesje of microscissors gebruikt onder handbediening weefsel veroorzaken aanzienlijke vervormingen die variabiliteit leidt in de diepte van de laesie 6. Dit kan leiden tot een verkeerde interpretatie van de gegevens in het bijzonder wanneer axonale regeneratie van specifieke studierichtingen wordt bestudeerd. Bijvoorbeeld kan gespaard dorsale corticospinal axons worden geïnterpreteerd als geregenereerde axonen als de dorsale corticospinal darmkanaal is niet helemaal doorgesneden bij de laesie. Deze problemen worden opgelost met een ruggengraat stabilisatieapparaat bevestigingsmateriaal om de facetten op een niveau en nauwkeurige laesie van het ruggemerg. Bovendien zou het gebruik ahoge frequentie oscillerend mes produceert een scherpe scheur zonder pletten of contusing de aangrenzende ruggenmerg. Deze werkwijze is gebruikt voor de productie ruggenmerg verwonding letsel bij ratten 9,12,14, met latere wijziging van thoracale ruggenmerg snijwonden produceren muizen 6. In deze mededeling, beschrijven we de methode van het creëren van betrouwbare cervicale letsels scheur in de muis.
Voorzover de achterwaartse diameter van het ruggenmerg is <2 mm in de muis, nauwkeurige diepte van de scheur laesie cruciaal zijn voor een betrouwbaar experimenteel model. Minimale variabiliteit in de laesie diepte zullen de resultaten van de experimenten beoordelen axonregeneratie evenals volumetrische en gedragsstudies aanzienlijk veranderen. De nauwkeurigheid van de laesiediepte deze methode is ± 0,01 mm omdat we gebruikten hoge precisie micro-stuurprogramma om de positie van het zaagblad te beheersen. Deze methode heeft de inconsistentie verminderdherent in andere modellen van het creëren van een scheur SCI. Deze werkwijze is bijzonder nuttig bij het bestuderen van axonale regeneratie van het ruggenmerg lange trajecten in de dorsale helft van het ruggenmerg, zoals de corticospinale tractus, de rubrospinale darmkanaal en de dorsale opgaande kanaal. Met deze methode kunnen deze vezelbanen volledig en betrouwbaar zijn doorgesneden. In dit opzicht zijn onjuiste interpretatie van gegevens geminimaliseerd, waardoor de betrouwbaarheid van de rapportage van experimenteel onderzoek van SCI.
Samengevat hebben we een nieuwe techniek beschreven om een reproduceerbare maken in vivo model van ruggenmerg verwonding schade in de muis. Deze techniek is gebaseerd op de rug stabilisatie door fixatie van de cervicale facetten en scheuren van het ruggenmerg met een oscillerend mes. Met behulp van deze methode in een dorsale thoracale ruggenmerg rijwond model in muizen 6, hebben we aangetoond een strakke correlatie tussen de scheur diepte, histologie, engedrag herstel. Een dergelijke techniek is ook gevonden betrouwbaar door verscheidene andere laboratoria 2,12.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De ontwikkeling van dit apparaat werd ondersteund door LISA Co, Louisville, Kentucky. Wij erkennen ook de voortdurende steun van Norton Healthcare, Louisville, KY naar CBS, en NIH NS050243, NS052290 en NS059622 te XMX.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Mice vertebral stabilizer | Louisville Impactor System | Stabilize and expose the cervical vertebra | |
| LISA vibraknife | Louisville Impactor System | Produce the laceration injury of the cervical spinal cord | |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15013-12 | Skin and trapezius muscle incision |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15023-10 | Separate muscles from the laminae |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15002-08 | Incision of dura |
| Graefe forceps | Fine Science Tools (USA) | 11154-10 | Retract skin |
| Dumont #7 forceps | Fine Science Tools (USA) | 11274-20 | Muscle retraction (tip modified)(Fig. A) |
| Dumont SS forceps | Fine Science Tools (USA) | 11203-25 | Fixation of vertebra (tip modified )(Fig.B) |
| 30G needle | Becton Dickenson | 305106 | Create a dural opening |
| 6-0 suture | Ethicon | 8806H | Close muscle and fascial layers |
| wound clip | Fine Science Tools (USA) | 12031-07 | Skin closure |
| Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | 90710-10G | Anesthetic agent |
Louisville Impactor System, Inc, 210 E. Gray St., Suite 1102, Louisville, KY 40202, (502) 629-5510, E-mail: cbshields1@gmail.com Fine Science Tools (USA), Inc, 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139, (800) 521-2109, E-mail: info@finescience.com Becton Dickenson, 1 Becton Drive, Franklin Lakes, NJ USA 07417, (201) 847-6800 Ethicon, Route 22 West, Somerville, NJ 08876 1-877-ETHICON Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA, 63178 (314) 771-5765, E-mail: cssorders@sial.com |
|||
| Figure A is the modified Dumont #7 forceps; B is the modified Dumont SS forceps. |
References
- Blackmore, M., Letourneau, P. C. Changes within maturing neurons limit axonal regeneration in the developing spinal cord. J. Neurobiol. 66 (4), 348 (2006).
- Blackmore, M. G., et al. Kruppel-like Factor 7 engineered for transcriptional activation promotes axon regeneration in the adult corticospinal tract. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 109 (19), 7517 (2012).
- Carbajal, K. S., et al. Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus. J. Vis. Exp. (53), e2834 (2011).
- Duhamel, G. Mouse lumbar and cervical spinal cord blood flow measurements by arterial spin labeling: sensitivity optimization and first application. Magn. Reson. Med. 62 (2), 430 (2009).
- Hermanns, S., Reiprich, P., Muller, H. W. A reliable method to reduce collagen scar formation in the lesioned rat spinal cord. J. Neurosci. Methods. 110 (1-2), 141 (2001).
- Hill, R. L. Anatomic and functional outcomes following a precise, graded, dorsal laceration spinal cord injury in C57BL/6 mice. J. Neurotrauma. 26 (1), 1 (2009).
- Iannotti, C. Dural repair reduces connective tissue scar invasion and cystic cavity formation after acute spinal cord laceration injury in adult rats. J. Neurotrauma. 23 (6), 853 (2006).
- Inman, D., Guth, L., Steward, O. Genetic influences on secondary degeneration and wound healing following spinal cord injury in various strains of mice. J. Comp Neurol. 451 (3), 225 (2002).
- Onifer, S. M., et al. Adult rat forelimb dysfunction after dorsal cervical spinal cord injury. Exp. Neurol. 192 (1), 25 (2005).
- Ramer, M. S., Harper, G. P., Bradbury, E. J. Progress in spinal cord research – a refined strategy for the International Spinal Research Trust. Spinal Cord. 38 (8), 449 (2000).
- Seitz, A., Aglow, E., Heber-Katz, E. Recovery from spinal cord injury: a new transection model in the C57Bl/6 mouse. J. Neurosci. Res. 67 (3), 337 (2002).
- Sivasankaran, R., et al. PKC mediates inhibitory effects of myelin and chondroitin sulfate proteoglycans on axonal regeneration. Nat. Neurosci. 7 (3), 261 (2004).
- Yu, P., et al. Inhibitor of DNA binding 2 promotes sensory axonal growth after SCI. Exp. Neurol. 231 (1), 38 (2011).
- Zhang, Y. P. Dural closure, cord approximation, and clot removal: enhancement of tissue sparing in a novel laceration spinal cord injury model. J. Neurosurg. 100, 343 (2004).
