تسيطر الاصابات تهتك عنق في الفئران
Summary
تقنية جديدة لإنشاء استنساخه<em> في الجسم الحي</emيوصف> نموذج من عنق الرحم الحبل الشوكي إصابة تمزق في الماوس. ويستند هذا الأسلوب على استقرار العمود الفقري عن طريق تثبيت للجوانب عنق الرحم وتهتك في النخاع الشوكي باستخدام شفرة تتأرجح مع دقة ± 0.01 ملم.
Abstract
استخدام الفئران المعدلة وراثيا يعزز فهمنا للآليات الجزيئية الكامنة وراء عدة اضطرابات عصبية مثل إصابات الحبل الشوكي (النخاع الشوكي). مرفوعة التحكم اليدوي تستخدم لإنتاج نموذج تهتك من اصابات النخاع الشوكي يخلق الإصابات لا تتفق كثيرا ما يرتبط مع عنصر سحق أو كدمة، وبالتالي، تم تطوير تقنية جديدة. وقد حل لدينا نموذج من عنق الرحم تهتك النخاع الشوكي الصعوبات المتأصلة مع أسلوب اليدوي من خلال دمج 1) تحقيق الاستقرار في العمود الفقري العنقي بواسطة تثبيت وجه من وجوه الفقري، 2) تعزيز التعرض الحبل الشوكي، و 3) إنشاء تهتك استنساخه من الحبل الشوكي باستخدام شفرة تتأرجح مع دقة ± 0.01 ملم في العمق بدون كدمة المرتبطة بها. بالمقارنة مع الطرق المعيارية لخلق تهتك النخاع الشوكي مثل استخدام مرفوعة من مشرط أو مقص، أنتجت طريقة لدينا آفة متسقة. وهذه الطريقة مفيدة لإجراء دراسات عن تجدد المحاور من corticospإينال، حمراوي نخاعي، ومساحات تصاعدي الظهرية.
Introduction
توافر الفئران المعدلة وراثيا هو أداة قوية لتحديد آثار جينات معينة تلعب دورا في آليات اصابات النخاع الشوكي. تهتك النخاع الشوكي هو نموذج هامة تستخدم لدراسة العوامل العلاجية أو الجزيئات التي يمكن أن توفر العلاج الفعال بعد هذه الاصابة 8. تثبيت من العمليات الشائكة خلال إنشاء إصابة تمزق في الفئران غير دقيقة بسبب صعوبة في استيعاب عمليات رقيقة وهشة الشائكة المشاركة مع الحفاظ على تثبيت العمود الفقري 5،11. تقلب في عمق تهتك من 0.2 ملم فقط (10٪ من القطر من الحبل الشوكي الماوس) يؤدي التفسير المضلل من البيانات. طبيعة ومدى الحبل الشوكي الآفة تهتك يجب تعريفها بدقة 10. لمواجهة هذا التحدي، قمنا بتطوير تقنية جديدة تتألف من استقرار العمود الفقري وتستخدم شفرات ملفقة تعلق على لويزفيل الاصابات جهاز نظام (LISA) لإنتاج تهتك النخاع الشوكي 7،14. تم إنشاء هذه الإصابة باستخدام شفرة حادة تتأرجح أن تجنب تشويه الأنسجة أثناء عملية تهتك. كان عمق تهتك دقيقة إلى دقة 0.01 ملم باستخدام الصغرى السائقين التي تتحكم في عمق تهتك. هي حسب الطلب شفرات القطع إلى الأشكال والاعراض محددة لإنشاء تهتك المطلوب كفاف 9. علينا أن نظهر 1) طريقة التعرض العمود الفقري العنقي، 2) أسلوب تحقيق الاستقرار الفقري باستخدام جهاز تثبيت الوجه الثنائية، و3) إنشاء إصابة تهتك عنق الرحم باستخدام شفرة تهتز.
Protocol
Representative Results
Discussion
لقد تم الحصول على استقرار العمود الفقري قبل إلى وقوع إصابات تهتك إلى الحبل الشوكي عن طريق تثبيت من العمليات الشائكة. كل من عنق الرحم العمود الفقري منحنى قعسي والتعلق من المشابك إلى تفتيت قصيرة العمليات الشائكة عنق الرحم من C3 من خلال T1 في الماوس منع استقرار العمود الفقري فعالة. وعلاوة على ذلك، واستخدام شفرة حلاقة أو microscissors تستخدم تحت التحكم اليدوي يسبب تشوه الأنسجة الهامة التي يخلق التباين في عمق الآفة 6. وهذا قد يؤدي إلى سوء تفسير البيانات وخاصة عندما يتم درس تجدد المحاور من مسارات محددة. على سبيل المثال، قد يساء تفسيرها يدخر المحاور القشري الظهرية كما المحاور مجدد إذا لم يكن مقطوع في السبيل القشري النخاعي الظهرية تماما في وقت lesioning. هذه التحديات يمكن التغلب عليها باستخدام جهاز تثبيت العمود الفقري مع تثبيت للجوانب على مستوى واحد وlesioning دقيقة من الحبل الشوكي. بالإضافة إلى ذلك، وذلك باستخدام هIGH تردد شفرة تتأرجح تنتج تهتك حاد دون سحق أو contusing النخاع الشوكي المجاورة. وقد استخدمت هذه الطريقة لإنتاج الشوكي اصابات الحبل تهتك في الفئران 9،12،14، مع التعديلات اللاحقة لإنتاج الصدري جروح الحبل الشوكي لدى الفئران 6. في هذا البلاغ، ونحن تصف طريقة لإنشاء موثوق بها تهتك عنق الرحم الآفات في الماوس.
بقدر القطر الأمامي الخلفي من الحبل الشوكي هو <2 مم في الماوس، أعماق الدقيق للآفة تهتك حيوية في خلق نموذج تجريبي موثوق بها. سوف تقلب الدنيا في عمق الآفة تغيير كبير نتائج التجارب تقييم تجديد محوار فضلا عن دراسات الحجمي والسلوكية. دقة عمق الآفة باستخدام هذا الأسلوب هو ± 0.01 ملم لأننا المستخدمة والدقة المتناهية الصغر السائقين عالية للسيطرة على الموقف من شفرة القطع. وقد خفضت هذه الطريقة عدم الاتساق فيمتأصل في نماذج أخرى من خلق تهتك النخاع الشوكي. هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص في دراسة تجدد المحاور مسارات الحبل الشوكي طويلة تقع في النصف الظهري في النخاع الشوكي، مثل السبيل القشري النخاعي، والمسالك حمراوي نخاعي، والمسالك الصاعدة الظهرية. مع هذا الأسلوب، يمكن لهذه الألياف تكون مساحات تماما ومقطوع بشكل موثوق. وفي هذا الصدد، يتم الحد من الأخطاء لتفسير البيانات، وبالتالي تحسين موثوقية التقارير من الدراسات التجريبية على اصابات النخاع الشوكي.
في ملخص، التي وصفناها تقنية جديدة لخلق نموذج يمكن استنساخه في الجسم الحي من عنق الرحم الحبل الشوكي إصابة تمزق في الماوس. ويستند هذا الأسلوب على استقرار العمود الفقري عن طريق تثبيت للجوانب عنق الرحم وتهتك في النخاع الشوكي باستخدام شفرة تتأرجح. باستخدام هذا الأسلوب في الحبل الشوكي الصدري نموذج تهتك الظهرية في الفئران 6، أثبتنا وجود علاقة بين عمق ضيق تهتك، علم الأنسجة، وانتعاش السلوك. تم العثور على هذه التقنية أيضا أن تكون موثوق بها من قبل العديد من المختبرات الأخرى 2،12.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد تطوير هذا الجهاز من قبل شركة ليزا، لويزفيل، كنتاكي. نحن نعترف أيضا الدعم المستمر من نورتون للرعاية الصحية، لويزفيل، KY لشبكة سي بي اس، والمعاهد الوطنية للصحة NS050243، NS052290، وNS059622 إلى XMX.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Mice vertebral stabilizer | Louisville Impactor System | Stabilize and expose the cervical vertebra | |
| LISA vibraknife | Louisville Impactor System | Produce the laceration injury of the cervical spinal cord | |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15013-12 | Skin and trapezius muscle incision |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15023-10 | Separate muscles from the laminae |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15002-08 | Incision of dura |
| Graefe forceps | Fine Science Tools (USA) | 11154-10 | Retract skin |
| Dumont #7 forceps | Fine Science Tools (USA) | 11274-20 | Muscle retraction (tip modified)(Fig. A) |
| Dumont SS forceps | Fine Science Tools (USA) | 11203-25 | Fixation of vertebra (tip modified )(Fig.B) |
| 30G needle | Becton Dickenson | 305106 | Create a dural opening |
| 6-0 suture | Ethicon | 8806H | Close muscle and fascial layers |
| wound clip | Fine Science Tools (USA) | 12031-07 | Skin closure |
| Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | 90710-10G | Anesthetic agent |
Louisville Impactor System, Inc, 210 E. Gray St., Suite 1102, Louisville, KY 40202, (502) 629-5510, E-mail: cbshields1@gmail.com Fine Science Tools (USA), Inc, 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139, (800) 521-2109, E-mail: info@finescience.com Becton Dickenson, 1 Becton Drive, Franklin Lakes, NJ USA 07417, (201) 847-6800 Ethicon, Route 22 West, Somerville, NJ 08876 1-877-ETHICON Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA, 63178 (314) 771-5765, E-mail: cssorders@sial.com |
|||
| Figure A is the modified Dumont #7 forceps; B is the modified Dumont SS forceps. |
References
- Blackmore, M., Letourneau, P. C. Changes within maturing neurons limit axonal regeneration in the developing spinal cord. J. Neurobiol. 66 (4), 348 (2006).
- Blackmore, M. G., et al. Kruppel-like Factor 7 engineered for transcriptional activation promotes axon regeneration in the adult corticospinal tract. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 109 (19), 7517 (2012).
- Carbajal, K. S., et al. Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus. J. Vis. Exp. (53), e2834 (2011).
- Duhamel, G. Mouse lumbar and cervical spinal cord blood flow measurements by arterial spin labeling: sensitivity optimization and first application. Magn. Reson. Med. 62 (2), 430 (2009).
- Hermanns, S., Reiprich, P., Muller, H. W. A reliable method to reduce collagen scar formation in the lesioned rat spinal cord. J. Neurosci. Methods. 110 (1-2), 141 (2001).
- Hill, R. L. Anatomic and functional outcomes following a precise, graded, dorsal laceration spinal cord injury in C57BL/6 mice. J. Neurotrauma. 26 (1), 1 (2009).
- Iannotti, C. Dural repair reduces connective tissue scar invasion and cystic cavity formation after acute spinal cord laceration injury in adult rats. J. Neurotrauma. 23 (6), 853 (2006).
- Inman, D., Guth, L., Steward, O. Genetic influences on secondary degeneration and wound healing following spinal cord injury in various strains of mice. J. Comp Neurol. 451 (3), 225 (2002).
- Onifer, S. M., et al. Adult rat forelimb dysfunction after dorsal cervical spinal cord injury. Exp. Neurol. 192 (1), 25 (2005).
- Ramer, M. S., Harper, G. P., Bradbury, E. J. Progress in spinal cord research – a refined strategy for the International Spinal Research Trust. Spinal Cord. 38 (8), 449 (2000).
- Seitz, A., Aglow, E., Heber-Katz, E. Recovery from spinal cord injury: a new transection model in the C57Bl/6 mouse. J. Neurosci. Res. 67 (3), 337 (2002).
- Sivasankaran, R., et al. PKC mediates inhibitory effects of myelin and chondroitin sulfate proteoglycans on axonal regeneration. Nat. Neurosci. 7 (3), 261 (2004).
- Yu, P., et al. Inhibitor of DNA binding 2 promotes sensory axonal growth after SCI. Exp. Neurol. 231 (1), 38 (2011).
- Zhang, Y. P. Dural closure, cord approximation, and clot removal: enhancement of tissue sparing in a novel laceration spinal cord injury model. J. Neurosurg. 100, 343 (2004).
