פגיעה קריעת צוואר הרחם מבוקרת בעכברים
Summary
טכניקה חדשנית ליצירת שחזור<em> In vivo</em> דגם של פגיעת קריעה חוט השדרה הצווארי בעכבר מתואר. טכניקה זו מתבססת על ייצוב עמוד השדרה על ידי קיבוע של היבטים בצוואר הרחם והקריעה של חוט השדרה באמצעות נדנוד להב עם דיוק של ± 0.01 מ"מ.
Abstract
שימוש בעכברים מהונדסים גנטי משפר את ההבנה של מנגנונים מולקולריים שבבסיס מספר הפרעות נוירולוגיות כגון פגיעה בחוט השדרה (SCI) שלנו. שליטה ידנית ביד חופשית משמשת לייצור דגם קריעה של SCI יוצרת פציעות לא עקביות הקשורים לעתים קרובות עם למחוץ או חבלת רכיב, ולכן טכניקה חדשנית שפתחה. המודל של צוואר הרחם קריעה SCI פתר קשיים הכרוכים בשיטת יד חופשית על ידי שילוב של 1) ייצוב חוליות צוואר הרחם על ידי קיבוע פן בחוליות, 2) חשיפת חוט השדרה משופרת, ו3) יצירה של חתך לשחזור של חוט השדרה באמצעות להב עם נדנוד דיוק של ± 0.01 מ"מ בעומק ללא חבלה קשורה. בהשוואה לשיטות הסטנדרטיות של יצירת קריעה SCI כגון שימוש ביד חופשית של אזמל או מספריים, השיטה שלנו יצרה נגע עקבי. שיטה זו שימושית עבור מחקרים על התחדשות axonal של corticospinal, rubrospinal, ושטחים עולים הגבי.
Introduction
הזמינות של עכברים מהונדסים גנטי היא כלי רב עוצמה כדי לזהות את ההשפעות של גנים ספציפיים שמשחקים תפקיד במנגנונים של SCI. קריעה SCI הוא מודל חשוב המשמש לבחינת סוכנים או מולקולות טיפוליים שעשויים לספק טיפול יעיל בעקבות פציעה זה 8. הקיבעון של תהליכי spinous במהלך יצירה של פציעת חתך בעכברים אינו מדויק בשל הקושי באחיזת תהליכי spinous הדקים ושברירית מעורב עם שמירה על קיבוע עמוד השדרה 5,11. השתנות בעומק של חתך של 0.2 מ"מ בלבד (10% מקוטרו של חוט השדרה עכבר) גורמת לפרשנות מטעה של נתונים. האופי וההיקף של נגע קריעה חוט השדרה חייבים להיות מוגדר 10 בדיוק. כדי להתמודד עם אתגר זה, פיתחנו שיטה חדשנית הכוללת ייצוב השדרה ומשמש להבים מפוברקים שצורפו לואיוויל מכשירי מערכת הפציעה (ליסה) כדי לייצר קריעה SCI 7,14. פציעה זו נוצרה על ידי שימוש בלהב נדנוד חד שנמנע עיוות רקמה בזמן תהליך קריעה. העומק של חתך היה מדויק ברמת דיוק של 0.01 מ"מ על ידי שימוש במייקרו נהגים השולטים על עומק קריעה. להבים לחיתוך הם מחוייט לצורות ורוחב ספציפיים כדי ליצור את קווי המתאר הרצוי קריעה 9. אנו מדגימים 1) שיטה של חשיפת עמוד השדרה הצווארי, 2) טכניקה של ייצוב השדרה באמצעות מכשיר קיבוע פן הבילטראלי, ו3) יצירה של פציעת חתך בצוואר רחם באמצעות סכין רוטט.
Protocol
Representative Results
Discussion
ייצוב החוליות לפני קריעת פציעות בחוט השדרה שהושג על ידי קיבוע של תהליכי spinous. גם עקומת עמוד השדרה הצווארי lordotic וההתקשרות של מלחציים לתהליכי צוואר הרחם הקצרים תפזורת spinous מC3 דרך T1 בעכבר למנוע ייצוב עמוד השדרה יעיל. יתר על כן, שימוש בסכין גילוח או microscissors מנוצל תחת שליטה ידנית גורמת לעיוות משמעותית רקמה שיוצרת השתנות בעומק של 6 הנגע. זה עשוי להוביל לפירוש לא הנכון של הנתונים במיוחד כאשר התחדשות axonal של מסלולים ספציפיים שלמדה. לדוגמה, האקסונים corticospinal גב חסכו עלולים להתפרש שלא כהלכה כאקסונים התחדשות אם מערכת corticospinal הגבי לא transected לחלוטין בזמן lesioning. ניתן להתגבר על אתגרים אלה על ידי שימוש במכשיר ייצוב עמוד השדרה עם קיבוע להיבטים ברמה יחידה וlesioning המדויק של חוט השדרה. בנוסף, שימוש באהלהב נדנוד תדירות igh מייצר קריעה חדה ללא ריסוק או מבלבל חוט השדרה הסמוך. בשיטה זו נעשתה שימוש כדי לייצר פציעות קריעת חוט השדרה בחולדות 9,12,14, עם השינויים הבאים כדי לייצר חתכים בעמוד השדרה החזי ב6 עכברים. בתקשורת הנוכחית, אנו מתארים את השיטה של יצירת נגעים בצוואר הרחם קריעה אמינות בעכבר.
ככל שקוטר anteroposterior של חוט השדרה הוא <2 מ"מ בעכבר, עומק מדויק של נגע קריעה הוא חיוני ביצירת מודל ניסיוני אמין. שונות מינימאלי בעומק הנגע באופן משמעותי תהיה לשנות תוצאות של ניסויי הערכת התחדשות אקסון, כמו גם מחקרי נפח והתנהגותי. הדיוק של עומק הנגע בשיטה זו הוא ± 0.01 מ"מ כיוון שהשתמשנו במייקרו דיוק נהגים גבוהים כדי לשלוט על המיקום של להב החיתוך. שיטה זו צמצמה את חוסר העקביות בHerent בדגמים אחרים של יצירת קריעה SCI. שיטה זו שימושית במיוחד בחקר התחדשות axonal של חוט השדרה הארוך משעולים הממוקם במחצית הגב של חוט השדרה, כגון מערכת corticospinal, מערכת rubrospinal, ומערכת עולה הגבי. באמצעות שיטה זו, קטעי סיבים אלה יכולים להיות לחלוטין וtransected באופן מהימן. במובן זה, טעויות של נתונים לפרשנות הן מזעריות, ובכך לשפר את אמינות דיווח של מחקרים ניסיוניים בSCI.
לסיכום, יש לנו תאר טכניקה חדשנית כדי ליצור שחזור במודל vivo של פגיעת קריעה חוט השדרה הצווארי בעכבר. טכניקה זו מתבססת על ייצוב עמוד השדרה על ידי קיבוע של היבטים בצוואר הרחם והקריעה של חוט השדרה באמצעות להב נדנוד. שימוש בשיטה זו במודל גב החזי קריעה חוט השדרה ב6 עכברים, הראה מתאם הדוק בין עומק חתך, היסטולוגיה, והתנהגות התאוששות. כגון טכניקה נמצאה גם להיות אמין על ידי מספר מעבדות אחרות 2,12.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
הפיתוח של מכשיר זה נתמכה על ידי ושות ליסה, לואיסוויל, קנטאקי. כמו כן, אנו מכירים את התמיכה המתמשכת של נורטון בריאות, Louisville, KY ללשכה מרכזית לסטטיסטיקה, וNS050243-NIH, NS052290, וNS059622 לXMX.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Mice vertebral stabilizer | Louisville Impactor System | Stabilize and expose the cervical vertebra | |
| LISA vibraknife | Louisville Impactor System | Produce the laceration injury of the cervical spinal cord | |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15013-12 | Skin and trapezius muscle incision |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15023-10 | Separate muscles from the laminae |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15002-08 | Incision of dura |
| Graefe forceps | Fine Science Tools (USA) | 11154-10 | Retract skin |
| Dumont #7 forceps | Fine Science Tools (USA) | 11274-20 | Muscle retraction (tip modified)(Fig. A) |
| Dumont SS forceps | Fine Science Tools (USA) | 11203-25 | Fixation of vertebra (tip modified )(Fig.B) |
| 30G needle | Becton Dickenson | 305106 | Create a dural opening |
| 6-0 suture | Ethicon | 8806H | Close muscle and fascial layers |
| wound clip | Fine Science Tools (USA) | 12031-07 | Skin closure |
| Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | 90710-10G | Anesthetic agent |
Louisville Impactor System, Inc, 210 E. Gray St., Suite 1102, Louisville, KY 40202, (502) 629-5510, E-mail: cbshields1@gmail.com Fine Science Tools (USA), Inc, 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139, (800) 521-2109, E-mail: info@finescience.com Becton Dickenson, 1 Becton Drive, Franklin Lakes, NJ USA 07417, (201) 847-6800 Ethicon, Route 22 West, Somerville, NJ 08876 1-877-ETHICON Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA, 63178 (314) 771-5765, E-mail: cssorders@sial.com |
|||
| Figure A is the modified Dumont #7 forceps; B is the modified Dumont SS forceps. |
References
- Blackmore, M., Letourneau, P. C. Changes within maturing neurons limit axonal regeneration in the developing spinal cord. J. Neurobiol. 66 (4), 348 (2006).
- Blackmore, M. G., et al. Kruppel-like Factor 7 engineered for transcriptional activation promotes axon regeneration in the adult corticospinal tract. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 109 (19), 7517 (2012).
- Carbajal, K. S., et al. Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus. J. Vis. Exp. (53), e2834 (2011).
- Duhamel, G. Mouse lumbar and cervical spinal cord blood flow measurements by arterial spin labeling: sensitivity optimization and first application. Magn. Reson. Med. 62 (2), 430 (2009).
- Hermanns, S., Reiprich, P., Muller, H. W. A reliable method to reduce collagen scar formation in the lesioned rat spinal cord. J. Neurosci. Methods. 110 (1-2), 141 (2001).
- Hill, R. L. Anatomic and functional outcomes following a precise, graded, dorsal laceration spinal cord injury in C57BL/6 mice. J. Neurotrauma. 26 (1), 1 (2009).
- Iannotti, C. Dural repair reduces connective tissue scar invasion and cystic cavity formation after acute spinal cord laceration injury in adult rats. J. Neurotrauma. 23 (6), 853 (2006).
- Inman, D., Guth, L., Steward, O. Genetic influences on secondary degeneration and wound healing following spinal cord injury in various strains of mice. J. Comp Neurol. 451 (3), 225 (2002).
- Onifer, S. M., et al. Adult rat forelimb dysfunction after dorsal cervical spinal cord injury. Exp. Neurol. 192 (1), 25 (2005).
- Ramer, M. S., Harper, G. P., Bradbury, E. J. Progress in spinal cord research – a refined strategy for the International Spinal Research Trust. Spinal Cord. 38 (8), 449 (2000).
- Seitz, A., Aglow, E., Heber-Katz, E. Recovery from spinal cord injury: a new transection model in the C57Bl/6 mouse. J. Neurosci. Res. 67 (3), 337 (2002).
- Sivasankaran, R., et al. PKC mediates inhibitory effects of myelin and chondroitin sulfate proteoglycans on axonal regeneration. Nat. Neurosci. 7 (3), 261 (2004).
- Yu, P., et al. Inhibitor of DNA binding 2 promotes sensory axonal growth after SCI. Exp. Neurol. 231 (1), 38 (2011).
- Zhang, Y. P. Dural closure, cord approximation, and clot removal: enhancement of tissue sparing in a novel laceration spinal cord injury model. J. Neurosurg. 100, 343 (2004).
