Controllata cervicale lesioni lacerazione nei topi
Summary
Una nuova tecnica per creare una riproducibile<em> In vivo</em> Modello di lesione lacerazione del midollo spinale cervicale nel topo è descritto. Questa tecnica si basa sulla stabilizzazione colonna vertebrale fissaggio delle faccette cervicali e lacerazione del midollo spinale utilizzando una lama oscillante con una precisione di ± 0,01 mm.
Abstract
Uso di topi geneticamente modificati, migliora la nostra comprensione dei meccanismi molecolari alla base di molti disturbi neurologici come una lesione del midollo spinale (SCI). Controllo manuale mano libera utilizzato per produrre un modello di lacerazione SCI crea lesioni incoerenti spesso associati a un componente di schiacciamento o contusione e, quindi, una nuova tecnica è stata sviluppata. Il nostro modello di lacerazione cervicale SCI ha risolto le difficoltà inerenti con il metodo a mano libera, incorporando 1) cervicale stabilizzazione vertebrale del fissazione vertebrale sfaccettatura, 2) l'esposizione maggiore del midollo spinale, e 3) la creazione di una lacerazione riproducibile del midollo spinale con una lama oscillante con una precisione di ± 0,01 mm di profondità senza contusione associata. Rispetto ai metodi standard di creazione di una lacerazione SCI come l'uso a mano libera di un bisturi o forbici, il nostro metodo ha prodotto una lesione coerente. Questo metodo è utile per studi sulla rigenerazione assonale di corticospinale, rubrospinal e dorsali tratti ascendenti.
Introduction
La disponibilità di topi geneticamente modificati è un potente strumento per identificare gli effetti dei geni specifici che svolgono un ruolo nei meccanismi di SCI. Lacerazione SCI è un importante modello utilizzato per esaminare gli agenti terapeutici o molecole che possono fornire un trattamento efficace a seguito di questo infortunio 8. Fissazione dei processi spinosi durante la creazione della lesione lacerazione nei topi è impreciso a causa della difficoltà nel cogliere i processi spinosi sottili e fragili coinvolti con il mantenimento fissazione spinale 5,11. Variabilità nella profondità della lacerazione di solo 0,2 mm (10% del diametro del midollo spinale topo) causa fuorviante interpretazione dei dati. La natura e l'estensione del midollo spinale lacerazione lesione devono essere definiti con precisione 10. Per affrontare questa sfida, abbiamo sviluppato una nuova tecnica composta da stabilizzazione vertebrale e usato lame fabbricati collegati alla Louisville Injury Sistema Apparatus (LISA) per produrre una lacerazione SCI 7,14. Questo pregiudizio è stato creato utilizzando una lama oscillante tagliente che evita la deformazione del tessuto durante il processo di lacerazione. La profondità della lacerazione è stato preciso con una precisione di 0,01 mm utilizzando micro-driver che controllano la profondità lacerazione. Lame di taglio sono su ordine alle forme e larghezze specifiche per creare la lacerazione desiderato contorno 9. Dimostriamo 1) il metodo di esposizione colonna cervicale, 2) la tecnica di stabilizzazione vertebrale utilizzando un dispositivo di fissaggio bilaterale sfaccettatura, e 3) la creazione di una lesione lacerazione cervicale utilizzando una lama vibrante.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stabilizzazione vertebrale prima lacerazione lesioni al midollo spinale è stato ottenuto fissazione dei processi spinosi. Sia la colonna vertebrale curva di lordosi cervicale e l'attaccamento dei morsetti ai friabili brevi processi spinosi cervicali C3 attraverso T1 nel topo impediscono la stabilizzazione della colonna vertebrale efficace. Inoltre, l'uso di una lametta o microscissors utilizzati sotto controllo manuale provoca deformazione dei tessuti significativo che crea variabilità nella profondità della lesione 6. Questo può portare alla errata interpretazione dei dati in particolare quando la rigenerazione assonale di percorsi specifici è studiato. Ad esempio, risparmiate dorsali assoni cortico possono essere erroneamente interpretati come assoni rigenerati se il dorsale tratto corticospinale non è stato completamente sezionato al momento della lesione. Queste sfide possono essere superate usando un dispositivo di stabilizzazione della colonna vertebrale con la fissazione per le sfaccettature di un unico livello e precisa lesione del midollo spinale. Inoltre, utilizzando ahigh frequenza lama oscillante produce una lacerazione affilato senza schiacciare o contusing l'adiacente midollo spinale. Questo metodo è stato utilizzato per produrre lesioni spinali lacerazione spinale in ratti 9,12,14, con successive modifiche per produrre lacerazioni toracici midollo spinale nei topi 6. Nella presente comunicazione, si descrive il metodo di creazione affidabili lesioni cervicali lacerazione nel topo.
Nella misura in cui il diametro anteroposteriore del midollo spinale è <2 mm nel topo, profondità precise della lesione lacerazione sono fondamentali nella creazione di un modello sperimentale affidabile. Variabilità minima nella profondità della lesione si altera in modo significativo i risultati di esperimenti che valutano la rigenerazione degli assoni e studi volumetrici e comportamentali. La precisione della profondità lesione utilizzando questo metodo è ± 0,01 millimetri perché abbiamo usato microtrasduttori alta precisione per controllare la posizione della lama di taglio. Questo metodo ha ridotto l'incoerenzaherent in altri modelli di creazione di una lacerazione SCI. Questo metodo è particolarmente utile nello studio rigenerazione assonale del midollo spinale lungo vie di trova nella metà dorsale del midollo spinale, come il tratto corticospinale, il tratto rubrospinal, e il tratto ascendente dorsale. Con questo metodo, questi tratti di fibre possono essere completamente affidabile e sezionato. A questo riguardo, errori di interpretazione dati sono minimizzati, migliorando così l'affidabilità della comunicazione di studi sperimentali sulla SCI.
In sintesi, abbiamo descritto una nuova tecnica per creare un modello in vivo riproducibile di lesione del midollo spinale cervicale lacerazione nel topo. Questa tecnica si basa sulla stabilizzazione colonna vertebrale fissaggio delle faccette cervicali e lacerazione del midollo spinale utilizzando una lama oscillante. Utilizzando questo metodo in una toracico del midollo spinale dorsale modello lacerazione nei topi 6, abbiamo dimostrato una stretta correlazione tra la profondità lacerazione, istologia, erecupero di comportamento. Tale tecnica è stata trovata anche per essere affidabili da molti altri laboratori di 2,12 componenti.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Lo sviluppo di questo dispositivo è stato sostenuto dalla LISA Co., Louisville, Kentucky. Riconosciamo anche il supporto costante di Norton Healthcare, Louisville, KY a CBS, e NIH NS050243, NS052290, e NS059622 a XMX.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Mice vertebral stabilizer | Louisville Impactor System | Stabilize and expose the cervical vertebra | |
| LISA vibraknife | Louisville Impactor System | Produce the laceration injury of the cervical spinal cord | |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15013-12 | Skin and trapezius muscle incision |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15023-10 | Separate muscles from the laminae |
| Spring Scissors | Fine Science Tools (USA) | 15002-08 | Incision of dura |
| Graefe forceps | Fine Science Tools (USA) | 11154-10 | Retract skin |
| Dumont #7 forceps | Fine Science Tools (USA) | 11274-20 | Muscle retraction (tip modified)(Fig. A) |
| Dumont SS forceps | Fine Science Tools (USA) | 11203-25 | Fixation of vertebra (tip modified )(Fig.B) |
| 30G needle | Becton Dickenson | 305106 | Create a dural opening |
| 6-0 suture | Ethicon | 8806H | Close muscle and fascial layers |
| wound clip | Fine Science Tools (USA) | 12031-07 | Skin closure |
| Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | 90710-10G | Anesthetic agent |
Louisville Impactor System, Inc, 210 E. Gray St., Suite 1102, Louisville, KY 40202, (502) 629-5510, E-mail: cbshields1@gmail.com Fine Science Tools (USA), Inc, 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139, (800) 521-2109, E-mail: info@finescience.com Becton Dickenson, 1 Becton Drive, Franklin Lakes, NJ USA 07417, (201) 847-6800 Ethicon, Route 22 West, Somerville, NJ 08876 1-877-ETHICON Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA, 63178 (314) 771-5765, E-mail: cssorders@sial.com |
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| Figure A is the modified Dumont #7 forceps; B is the modified Dumont SS forceps. |
References
- Blackmore, M., Letourneau, P. C. Changes within maturing neurons limit axonal regeneration in the developing spinal cord. J. Neurobiol. 66 (4), 348 (2006).
- Blackmore, M. G., et al. Kruppel-like Factor 7 engineered for transcriptional activation promotes axon regeneration in the adult corticospinal tract. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 109 (19), 7517 (2012).
- Carbajal, K. S., et al. Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus. J. Vis. Exp. (53), e2834 (2011).
- Duhamel, G. Mouse lumbar and cervical spinal cord blood flow measurements by arterial spin labeling: sensitivity optimization and first application. Magn. Reson. Med. 62 (2), 430 (2009).
- Hermanns, S., Reiprich, P., Muller, H. W. A reliable method to reduce collagen scar formation in the lesioned rat spinal cord. J. Neurosci. Methods. 110 (1-2), 141 (2001).
- Hill, R. L. Anatomic and functional outcomes following a precise, graded, dorsal laceration spinal cord injury in C57BL/6 mice. J. Neurotrauma. 26 (1), 1 (2009).
- Iannotti, C. Dural repair reduces connective tissue scar invasion and cystic cavity formation after acute spinal cord laceration injury in adult rats. J. Neurotrauma. 23 (6), 853 (2006).
- Inman, D., Guth, L., Steward, O. Genetic influences on secondary degeneration and wound healing following spinal cord injury in various strains of mice. J. Comp Neurol. 451 (3), 225 (2002).
- Onifer, S. M., et al. Adult rat forelimb dysfunction after dorsal cervical spinal cord injury. Exp. Neurol. 192 (1), 25 (2005).
- Ramer, M. S., Harper, G. P., Bradbury, E. J. Progress in spinal cord research – a refined strategy for the International Spinal Research Trust. Spinal Cord. 38 (8), 449 (2000).
- Seitz, A., Aglow, E., Heber-Katz, E. Recovery from spinal cord injury: a new transection model in the C57Bl/6 mouse. J. Neurosci. Res. 67 (3), 337 (2002).
- Sivasankaran, R., et al. PKC mediates inhibitory effects of myelin and chondroitin sulfate proteoglycans on axonal regeneration. Nat. Neurosci. 7 (3), 261 (2004).
- Yu, P., et al. Inhibitor of DNA binding 2 promotes sensory axonal growth after SCI. Exp. Neurol. 231 (1), 38 (2011).
- Zhang, Y. P. Dural closure, cord approximation, and clot removal: enhancement of tissue sparing in a novel laceration spinal cord injury model. J. Neurosurg. 100, 343 (2004).
