Rat Beyin gelen Serebral Yüzey damarları ve İlişkili Beyin zarları ve Diseksiyon ve Koroid Pleksus bir Görsel Açıklama

Video gösterilmemiş olmasına rağmen, fareler ilk olarak en az 3 dakika içinde anestezi ile sonuçlanan, pentobarbital, 300 mg / kg 'lik bir dozda verilmiş ve ardından dekapitasyon ile öldürüldü. Beyinleri hızla o vardı ama dikkatle kafatası çıkarılır ve 5 dakika buz-soğuk serum fizyolojik içinde soğutulmuş. Bu, önceki MAV (I üst tabaka) korteks yüzeyinden ayrılabilir, böylece MAV kesme için bu kadar süre için beyin soğuması için önemlidir. Beyin sonra buz-soğuk normal salin ya da 0.1 M sodyum fosfat-tamponlu salin pH = 7.4 dolu buz üzerine oturan bir cam petri tabak (1 cm derinlikte) alt kısmına yerleştirilmiştir. Bütün disseksiyon tuzlu batırılır çoğunlukla beyin ile yapılır. 1. Epifiz Bezi çıkarılması Beynin dorsal yüzü yukarı (Petri kabı altına göre) yerleştirin. Epifiz bezi t sadece rostral iki hemisfer arasındaki en kaudal ventral bölgede yer almaktadıro beyincik (pineal girinti), ve hemen altında ya da üstünde colliculi menenjlerin yüzeyinde yer almaktadır. İlk iki küçük bükük ucu forseps kullanarak epifiz bezi çıkarın. Bu korteks gibi pembe renklidir ancak genellikle kan ve beyin çıkartılmasından oluşan rezidüel damarlarda kalıntılarında çevrilidir. 2. MAV çıkarılması "Baş aşağı" üzerine beyin Flip ve vertebral arter, beyinin zarları ve yataktan pons kapsayan küçük arterler ve meninks ayırın. Önbeyin MAV çıkarılması işlemi başlar. Bu diseksiyon sürecinde ventral başlamak önemlidir. Willis daire büyük ana arterler, orta serebral arter (MCA) ve anterior arterler güçlü ve hangi "iskele" olarak hizmet pial daha küçük yüzeyel arter ve arteriyoller sonra membran zarları geri kalanı ile korteks çıkarılabilir. M için Scremin 7 tarafından gözden bakıncevher görsel temsillerini ve serebral vasküler yüzey ayrıntıları. Ya hemisfer ile başlayarak, internal karotis noktada sadece posterior posterior komünikan arter sever küçük bükük ucu forseps kullanın. Bu nedenle, ön beyin ve daha fazla ön ve arka arteriyel ağaçlar ayrılması. Kontralateral hemisferde için aynı işlemi tekrarlayın. MCA ve forseps ile anterior arter sürükleyici, ventral anterior korteks (piriform, olfaktör tüberkül) kapsayan MAV koku yolu üzerinde ve çevresinde kaldırdı böylece anterior-dorsal yönde yavaşça çekin. Bu kadar ön korteks (singulat ve orbita) kapsayan MAV ve kaldırır. Petri kabı 45 90 ° açıyla beyin çevirin. Lateral kortikal bölgeleri (granüler insular, ikincil somatosensoriyel ve işitsel korteks) çevreleyen MAV ve yanal, daha ön bölgelerde MCA ve ilişkili arter kavrayarak korteks kurtulmuş olabilirler ve yavaşça korteks boyunca dorsal çekerek. Gerekirse, forseps uçları diseksiyon sırasında korteks büyük damar kaldırmak ve serbest bırakmak için kullanılabilir. Şimdi MAV ve daha posterior lateral alanların çıkarın. (Not, bu MAV soğuk ve nemli kalmasını sağlamak için bu hasat işlemi sırasında diğer bir hemisfer geçmek için en iyisidir. Ayrıca, korteks MAV kurtarmada direnci geçici kontralateral hemisferde bir yarımkürede anahtarı karşılaşılırsa ve daha sonra orijinal yarımkürede geri dönün.) Birincil somatosensoriyel çevreleyen MAV en dorsal bölgelerin çıkarılması ve motor korteks, beynin dorsal yüzü yukarı (Petri kabı altına göre) açmak için. Nihayet beyin MAV boşaltmak için sagital sinüs boyunca forseps uçları kullanılır. Avlanan MAV bu kısmı da test ve analiz kadar buz soğuk tuzlu geçici muhafaza veya daha sonra işlenmek için dondurulabilir. Sık sıkkorteksin en arka / kaudal bölgelere (entorinal görsel ve en kaudal işitsel korteks) kapsayan MAV kortekse bağlı kalır. Onun kaldırma retrosplenial korteks ve colliculi kayaçları arasında MAV disseke edilir videoyu daha sonra gösterilir. 3. Koroid Pleksus çıkarılması Beynin dorsal yüzü yukarı yerleştirin ve büyük forseps hemisfer arasındaki orta hat boyunca küçük forseps aşağı doğru itin ve ardından üst içine korteks ve korpus kallozum (bregma itibaren ≈ -3.3 mm) sayesinde delinme uçları kullanan ile yerde tutun hipokampus midline. Lateral ventrikül çoğu açığa dorsal hipokampus ve septum uzak kallozum ile korteks çekmek için forseps kullanın. Koroid pleksus bulunan ve uzunluğu çalışan ana arter demarcating dalgalı kırmızı çizgi ile tespit edilebilir. Üçüncü ven ve yan duvarları manivela için forseps iki ucunu kullanaraktricle ve en kaudal ucunu (bregma 8 ≈ -4.3 mm) büyütebilirsiniz. Küçük forseps kullanarak, koroid pleksus ücretsiz bu ucunu çekin. Sonra septum ve kaudat / putamen arasındaki çok ön bölgede (en rostral ölçüde, bregma itibaren ≈ +1.6 mm) gidin ve forseps ventrikülün bu bölümü büyütmek ve koroid pleksus ücretsiz çekme ile. İkinci kalan koroid pleksus elde kontralateral hemisferde aynı prosedürü uygulayın. Yine bu doku ya da test ve analiz kadar buz soğuk tuzlu geçici muhafaza veya daha sonra işlenmek için dondurulabilir. 4. Retrosplenial, İşitsel ve Görsel korteks dahil kortekin daha Kaudal Bölgeleri yanı sıra bu Talamus ve Colliculi örten 3. Ventrikülde Kalan MAV çıkarılması Talamus ve colliculi üzerinde MAV açığa her iki yarımkürede gelen tüm hipokampus çıkarın. Ve kaldırmaMAV bu bölümü, korteks üzerinde MAV çıkarılması çok daha zordur. Talamus ön kısmını örten ve nazikçe kaudal çekerek büyük damar tutarak MAV ücretsiz bu kısmı çekin. Bu, vasküler üstü collicular ağa bağlı olan ve dorsal hipokampus ve dorsal talamus ağ için kan tedarik edilir. Kaudal arteriyel daire damarlanmanın son bölümlerini ulaşıncaya kadar kaudal ve yavaş yavaş serbest supracollicular ağ uzağa çekin. Bu noktada, daha fazla bakım taneli retrosplenial, birincil işitsel ve görsel korteksleri yüzey üzerinde kalan arka karın MAV ortadan kaldırmak için dikkat edilmelidir. Korteks daha fazla ön kısımları kapsayan MAV bir diğer bölümü ile olduğu gibi, bu doku ya da test ve analiz zamanına kadar buz gibi soğuk tuzlu su içinde geçici olarak muhafaza edilebilir veya daha sonra işlenmek için dondurulur. Bu ikinci bölüm MAV ile hasat edilmiş, kalan arka karın MAV bir kaldırılması gerekirayrı ayrı analiz edilmelidir eğer d korteks kapsayan ilk disseke MAV bölümüne eklendi. 5. Temsilcisi Sonuçlar Diseksiyon doğru olarak yürütülür, sonuçta elde edilen MAV dokulara 45-35 mg toplam ağırlığında iki dokunulmamış varlık içinde olmalıdır. Korteksin en çevreleyen başlangıçta disseke MAV 25 mg ve talamus kapsayan MAV hakkında tartmak gerekir, colliculi ve oksipital kortekste yaklaşık 15 mg tartmak gerekir. Bu damar içinde kan kalıntı renk olarak hafifçe pembemsi olmalıdır. Iki taraflı koroid pleksus hasat edilen her bir tartı 1-2 mg ile iki tam doku numuneleri içinde olmalıdır. Fazla su doku kaybını önlemek için, bu tür lens temizleme kullandığı gibi kağıt mendil kullanarak depolama veya işleme öncesi MAV kaldırılabilir rağmen disseke koroid pleksus gelen aşırı su çıkarmak için iyi bir fikir değildir. Şekil 1 için oluşturulmuş oldu ifadesi profil karşılaştırarak kullanarak kontrol koşulları altında üç bölgede es (striatum, parietal korteks ve MAV) Agilent-014879 Tüm Rat Genom 4x44K 60mer oligonükleotid dizileri (G4131F, Agilent Technologies, Palo Alto, CA; NCBI GEO Katılım # GPL7294; GSE23093 ve de mevcut GSE29733 NCBI GEO depo). 1) striatum parietal korteks göre ve 2) MAV parietal korteks ile kıyaslandığında resimde iki arsa pictorially ifadeyi gösterir. Bu striatum ve parietal korteks çok daha yakından MAV dışında birbirleriyle ilişkili olduğu açıktır. MAV ile koroid pleksus karşılaştıran veriler, gelecekteki bir yayında sunulacaktır. Ancak, MAV ve koroid pleksus ifadeyi profilleri daha yakından striatum ve parietal korteks için olandan birbirleriyle ilişkili olması muhtemeldir. Şekil 2 MAV yılında diferansiyel gen ekspresyonu hipertermi yanıt (EIH) karşı AMPH karşılaştırıldığında gösterir kontrol etmek ve her bir diğer için. içerik "> kontrol hayvanlarının MAV resmi NCBI gen sembolleri ile 11,000 'den fazla genin gen ekspresyonu striatum ve parietal kortekste kaydedilmiş kıyasla edildi. bu genlerin 2000'den fazla MAV içinde bir 2.5 kat veya daha fazla farklı ekspresyonu İki nöronal zengin dokular ile karşılaştırıldığında, 550 gen ifadesinde 10 kat büyük bir fark vardı. Bunlardan biraz fazla 40% (253) 10 kat veya MAV daha azalmış bir ifade ile gen ve ilişkili olduğu nöronal fonksiyonu. 343 genler parietal korteks ve striatum kıyasla MAV bir 10 kat veya daha fazla ifadesi vardı. genlerin Bu liste MAV çok yüksek zenginleştirme ile genleri belirlemek için bir başlangıç ​​noktası olarak kullanılmıştır. Tablo MAV 15 kat ifade büyük olan 1 listeleri genler parietal korteks ve striatum ile karşılaştırıldığında ve fonksiyon açısından bunları sınıflandırır. Bu genlerin çoğu damar sistemi ve / veya bağışıklık sistemi ile ilişkili bulunmuştur. Bu tgenlerin Dosya türleri yaklaşık 5 zenginleştirilmiş olmalıdır – 10 – çünkü artan damar kendisi ve içinde bulunan kan kat. Ancak, hatta bilinen genel vasküler fonksiyonları ile genler için, 15 kat üzerinde bir artış MAV zenginleşme gösterir. Genlerin numaraları edildi çok büyük bir kat değişiklik ile de olmamıştır; 1) hücre dışı matris proteinleri (özellikle damar ile ilgili olmayan), 2) çözünen taşıyıcı ve 3) lipit ve retinoik asit metabolizması. De, birkaç büyüme ve farklılaşma gen veya transkripsiyon faktörleri bulunmuştur gibi. Şekil 1. Parietal korteks ve striatum ile MAV yılında Gen Ekspresyonu karşılaştırılması. Parietal korteks ve striatum (üst plot) ve parietal korteks ve MAV (alt çizim) gen ekspresyonu düzeylerinin karşılaştırılması Volkan arsa. Kırmızı semboller önemli ölçüde farklı betwe olan genlerin ifadetr p bölgeler <0.05 ve bölgeler arasında 1.5 kat veya daha fazla diferansiyel ifadesi var. Siyah semboller anlamlı (p> 0.05) bölgeleri arasındaki farklılık genlerin temsil ve 1.5 kat ifadede farklı daha azdır. Pembe semboller p <0.05 düzeyinde ifadesinde 1.5 kat fark daha az, ancak istatistiksel olarak anlamlı farklı olan genleri gösterir. Sarı semboller 1.5 kat veya daha fazla ifadeye sahip genleri tanımlamak ama bu değişim p <0.05 istatistiksel olarak anlamlı değildir. Kısaltmalar AMPH amfetamin EIH çevre kaynaklı hipertermi MAV meninksler ve ilişkili beyin damarlarında Norm normotermik kontrol Şekil 2. Karşılaştırarak hipertermi ve MAV gen ekspresyonu amfetamin Etkileri. Volcano araziler3 saat zaman noktalarında, tuzlu su, EIH veya AMPH sonra MAV gen ekspresyonunun seviyeleri. Kırmızı semboller siyah noktalar / çevrelerde önemli bölgeler arasında farklılık yoktur genleri temsil ederken önemli ölçüde farklı olduğu düşünülen genlerin ifade. Ek istatistiksel analiz kontrolü ve tedaviler arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlı aslında vardı hangi ifadeyi doğrulamak için kullanıldı. MAV İfade Beyin Anlatım NCBI Gen Sembolleri Doku Özgünlük veya Dolaylı Görev (ler) > 50 kat Col8a1 Anxa2 bir, Des, Esm1, Glycam1, Kl bir, Lect1, leptin reseptör, Lum, Myh11, OGN, Tagln, Thbs2, Tnnt2 Damarları ve Kalp > 50 kat Ccl19, Cd74 a, Defb1, Lrrc21, Mgl1, Mrc1, Msln, Pla2g5, Prg4, RT1-Bb, RT1-Da Bağışıklık Sistemi > 50 kat ADH1, Aebp1, Aldh1a2, Gstm2 Retinoik Asit ve Lipit İşleme > 50 kat Cdh1, Col3a1, Col1a2, Colec12, Cpxm2, CPZ, DCN, Emp3, Gpc3, Nupr1, Omd, Pcolce Slamf9, Tmem27, Tspan8 Ekstrasellüler Matriks ve hücre-hücre kavşaklar > 50 kat Aqp1, Asgr1, Kcnj13, Slc5a5, Slc6a13, Slc6a20, Slc22a6, Sned1, Ttr İyon ve Katı Homeostazı > 50 kat Alx3, Cdkn1c, Foxc2, Igfbp2, Ifitm1, Ifitm2, Nkx6-1, Osr1, Prrx2, Sfrp1, Tbx15. Upk1b, Wisp2, Wnt6 Geliştirme ve Transkripsiyon Yönetmeliği > 50 kat Gpha2, Mfap5, Mpzl2 Plac8, Scgb1c1, Sostdc1, Steap1 Bilinmeyen & Çeşitli 30 ile 50 kat </td> Anxa1 a, Angpt2, C6 bir, GJB2, Ptgis, Thbd, Timp1 Damarları ve Kalp 30 ile 50 kat Casp12, CCl2, CCR1, CD14, Cxcl10, Ifitm3, Klra5, Lgals1, Lgals3, Ms4a4a, Ms4a7, Plscr1, Spp1, Xcl1 Bağışıklık Sistemi 30 ile 50 kat Col6a3, Cpxm1, Efemp1, fmod, MGP, Nid2 Ekstrasellüler Matriks ve hücre-hücre kavşaklar 30 ile 50 kat Cp, Cubn, Gcgr, S100a6, Scn7a, Sct, Slc4a5, Slc16a11, Slco1a5 İyon ve Katı homeostazı 30 ile 50 kat CFD, Ch25h, Crabp2, Rarres2 Retinoik Asit ve Lipit İşleme 30 ile 50 kat BMP6, Casp12, DAB2, Folr1, Igf2, Msx1, Tbx18, Twist1, Wnt5b Geliştirme ve Transkripsiyon Yönetmeliği 30 ile 50 kat Cela3b, Cln6, C1qtnf7, Copz2, Dhrs7c, Gng11, Prss23, Srpx, Vim Bilinmeyen & Çeşitli 15 30-kat Amiral, Angpt1, Angptl2, BGN, Cklf bir, Cnn1, Cox8h, Ctsk, F13a1, Gja5, Klf4, Lox, Lyz, Myl9, Procr, Pros1, RT1-Ba, Serpinb10, Serping1, Serpinf1, Tgm2, Tnmd, Trim63, Txnip a, Vamp5, VTN Damarları ve Kalp 15 30-kat Ada, Bst2, Ccl6, CD40, CD68, Ctsc, Dap, Faim3, Fkbp9, Fxyd5, Fmo1, Glipr1, Ier3, Ifi47, Igsf6, Msc, Nfatc4, RT1-db1, Serpinb1a, Tir4, Tubb6 Bağışıklık Sistemi 15 30-kat Adamtsl4, COL1A1, Crb3, Dpt, Egfl3, FBN1, Fbln1, Fbln5, FN1, Itgb4, Lama2, Lgals3bp, Loxl1, Mfap4, Mmp14, Mmp23, Ppic, Serpinh1, TIMP3 Ekstrasellüler Matriks ve hücre-hücre kavşaklar 15 30-kat Cybrd1, Selenbp1, Slc2a4, Slc9a2, Slc13a3, Slc16a4, Slc22a8, Slc22a18 İyon ve Katı homeostazı 15 30-kat Agpat2, Bdh2, Cyp26b1, Lpar3, Ltb4dh, Olr1, PON3, Rbp1, Rbp4 Retinoik Asit ve Lipit İşleme 15 30-kat Atf3, Dkk4, Eya2, Ifitm7, Ltbp1, Mustn1, Nr2f2, ptrf, Sphk1, Tgfbi, Tcea3 Tcfap2b, Wnt2b, Wnt5a, Zic1 Geliştirme ve Transkripsiyon Yönetmeliği 15 30-kat Adamts12, Adamtsl3, C1r, Crispld2, Crygn, CYP1B1, Dse, Enpep, Enpp2, Epn3, Flna, Fmo3, Gnmt, Gprc5c, Hspb1, Klc3, Krt18, Krt19, MDK, Mesp1, Ms4a6a, Ms4a6b, Ms4a11, net1, Pdlim2, Phactr2, Plp2, Ppp1r3b, Pqlc3, Rin3, Spag11, Sult1a1, Tmem106a, Wfikkn2 Bilinmeyen & Çeşitli * Tabloda yer Genler striatum ve pariet hem fazla 15 kat yukarıda ifadesi olmalıdıral korteks ve arka plan seviyelerinin üzerinde 5 kat. Her gen için iki oranları (MHA / veya striatum MAV / parietal korteks) alt gruplandırma için kullanılmıştır. Bir Genler endotel hücrelerinde bulunan ama aynı zamanda büyük olasılıkla bağışıklık yanıtları arabuluculuk önemli bir rol oynarlar. Tablo 1. 15 kat * veya striatum ve parietal korteks kıyasla MAV daha artmış ekspresyonu ile Genler.