Une description visuelle de la dissection de la vascularisation cérébrale et de surface associées Méninges et le plexus choroïde du cerveau de rat

Bien que non représenté dans la vidéo, les rats ont d'abord reçu une surdose de 300 mg / kg de pentobarbital, résultant en anesthésie en moins de 3 min, puis tués par décapitation. Leurs cerveaux ont ensuite été rapidement mais soigneusement retirée du crâne et refroidi dans la glace froide saline normale pendant 5 min. Il est important de laisser refroidir le cerveau de ce laps de temps avant la dissection de la MAV de sorte que la MAV peut être séparée de la surface du cortex (couche supérieure de I). Le cerveau a ensuite été placé dans le fond d'un plat en verre de Pétri reposant sur la glace qui était plein (1 cm de profondeur) des glacé solution saline normale ou de sodium 0,1 M de tampon phosphate salin pH = 7,4. Toute la dissection se fait avec le cerveau pour la plupart plongés dans une solution saline. 1. Retrait de la glande pinéale Placer le haut côté dorsal du cerveau (par rapport au fond de la boîte de Pétri). La glande pinéale est située dans la région la plus caudale ventrale entre les deux hémisphères juste rostrale à til cervelet (évidement pinéale), et il est juste en dessous ou à la surface des méninges au cours de la colliculi. Retirer la glande pinéale de la première utilisation de deux petites pinces à bout courbé. Il est de couleur rose comme le cortex, mais est souvent entouré de restes de sang et le système vasculaire résiduel de l'élimination du cerveau. 2. Suppression de la MAV Retournez le cerveau sur "upside down" et de séparer l'artère vertébrale, les petites artères et des méninges portant sur la protubérance du système vasculaire des méninges et du cerveau antérieur. Suppression de la MAV cerveau antérieur est alors démarré. Il est important de commencer ventralement dans le processus de dissection. Les grandes artères majeures du cercle de Willis, artères cérébrales moyennes (MCA) et les artères antérieures sont les plus forts et servir de «échafaudage» par lequel les petites artères et artérioles superficielles de la pie-mère membrane peut alors être retiré du cortex et le reste des méninges. Voir toutes les évaluations par Scremin 7 pour mminerai de représentations visuelles et les détails de la vascularisation cérébrale. surface À commencer par les deux hémisphères, utilisez la pince petites pointes recourbées à couper l'artère communicante postérieure juste en arrière de la jonction de la carotide interne. Ainsi, en séparant les arbres plus antérieure et postérieure des artères du cerveau antérieur. Répétez le même processus pour l'hémisphère controlatéral. Saisir le MCA et l'artère interventriculaire antérieure avec la pince, tirer doucement dans une direction antérieure-dorsale de telle sorte que la MAV couvrant le cortex antérieur ventral (piriforme, tubercule olfactif) est soulevée au-dessus et autour de l'appareil olfactif. Cela supprime une grande partie de la MAV couvrant le cortex antérieur (cingulaire et orbital). Tournez le cerveau à un angle de 45 à 90 ° vers la boîte de Pétri. Les latéraux, les régions plus antérieures de la MAV entourant les régions corticales latérales (granulaire insulaire, somatosensoriel secondaire et le cortex auditif) peuvent être libérés à partir du cortex en saisissant le MCA et associée arters et en tirant doucement le long de la face dorsale du cortex. Le cas échéant, les extrémités de la pince peut être utilisée pour soulever et libérer les artères principales du cortex pendant la dissection. Maintenant, enlevez les régions plus postérieures latérales de la MAV. (Remarque: il est préférable de passer d'un hémisphère à l'autre au cours de ce processus de récolte pour s'assurer que le MAV reste froid et hydratée. Par ailleurs, si la résistance à libérer la MAV à partir du cortex est rencontré sur un commutateur hémisphère à l'hémisphère controlatéral temporairement puis revenir à l'hémisphère d'origine plus tard.) Pour supprimer les régions les plus dorsales de la MAV autour de la somato-sensoriel primaire et le cortex moteur tourner jusqu'à la face dorsale du cerveau (par rapport au fond de la boîte de Pétri). Enfin à libérer la MAV de cerveau, utiliser les extrémités de la pince le long du sinus sagittal. Cette partie de la MAV récoltées peuvent être soit conservées temporairement dans une solution saline glacée jusqu'à ce que les tests et l'analyse ou congelés pour un traitement ultérieur. Souventla MAV couvrant les régions les plus postérieures / caudale du cortex entorhinal (cortex auditifs, visuels et la plus caudale) reste attaché au cortex. Son retrait est indiqué plus loin dans la vidéo lorsque la MAV entre le cortex rétrosplénial et recouvrant les colliculi sont disséqués. 3. Le retrait du plexus choroïde Placez le côté dorsal du cerveau et maintenir en place avec des pinces plus grandes Pousser la pince vers le bas les petits travers la ligne médiane entre les deux hémisphères, puis utilisez les extrémités pour percer à travers le corps calleux cortex et corpus (≈ -3,3 mm à partir du bregma) dans le haut de la ligne médiane de l'hippocampe. Utilisez la pince pour tirer le cortex avec calleux loin de l'hippocampe dorsal et du septum, ce qui expose la plupart du ventricule latéral. Le plexus choroïde peut être localisé et identifié par la ligne ondulée rouge délimitant la grande artère qui passe sa longueur. Utiliser les deux extrémités de la pince pour soulever les parois latérales de la troisième ventricle et l'agrandir à l'extrémité la plus caudale (≈ -4,3 mm du bregma 8). À l'aide des petites pinces, tirer cette extrémité du plexus choroïde libre. Ensuite, allez à la région très antérieure entre le septum et du noyau caudé / putamen (mesure la plus rostrale, ≈ 1,6 mm de bregma) et avec la pince agrandir cette section du ventricule et tirez sur le plexus choroïde libre. Effectuez la même procédure sur l'hémisphère controlatéral pour obtenir le deuxième choroïde plexus restante. Encore une fois ce tissu peut être soit conservées temporairement dans une solution saline glacée jusqu'à ce que les tests et l'analyse ou congelés pour un traitement ultérieur. 4. Suppression de la MAV restant dans le ventricule 3 ème Recouvrant le thalamus et le colliculi ainsi que celle sur les régions plus caudal de l'Cortex y compris rétrosplénial, Cortex auditif et visuel Retirer l'hippocampe ensemble des deux hémisphères exposant la MAV sur le thalamus et colliculi. La suppression descette partie de la MAV est beaucoup moins difficile que la suppression de la MAV sur le cortex. Tirez cette partie de la MAV libre en saisissant la plus grande vascularisation recouvrant la partie antérieure du thalamus et en tirant doucement caudale. Ce système vasculaire est connecté au réseau colliculaire précité et irrigue l'hippocampe dorsal et le réseau dorsal du thalamus. Retirez-le en bas et progressivement le réseau sans supracollicular jusqu'à atteindre les dernières portions de la vascularisation cercle artériel caudal. À ce stade, plusieurs précautions doivent être prises pour éliminer tout reste de MAV ventral postérieur à la surface de la rétrosplénial granulaire, auditif primaire et cortex visuel. Comme avec l'autre section de la MAV couvrant les parties plus antérieures du cortex, ce tissu peut être soit conservées temporairement dans une solution saline glacée jusqu'à ce que les tests et l'analyse ou congelés pour un traitement ultérieur. Tout reste MAV ventral postérieur récoltés avec cette deuxième partie MAV doit être retiré d'und a ajouté à la section MAV disséqué premier couvrant le cortex si elles doivent être analysés séparément. 5. Les résultats représentatifs Lorsque la dissection est exécutée correctement, les tissus résultant VAC doit être en deux entités intactes pesant environ 35 à 45 mg au total. Le premier disséqué MAV qui entoure la plupart du cortex devrait peser environ 25 mg et la MAV couvrant le thalamus, colliculi et cortex occipital doit peser environ 15 mg. Il devrait être légèrement rosâtre en couleurs à partir du sang résiduel dans le système vasculaire. Le bilatérale du plexus choroïde récolté doit être dans deux échantillons de tissus intacts pesant chacun avec 1 à 2 mg. Bien que l'excès d'eau peut être retiré de la MAV avant le stockage ou le traitement avec du papier tel que celui utilisé dans le nettoyage de la lentille, afin d'éviter la perte de tissu ce n'est pas une bonne idée d'enlever l'excès d'eau de la choroïde plexus disséqué. Figure 1 a été généré pour comparant profil d'expression es dans trois régions (striatum, le cortex pariétal et MAV) dans des conditions de contrôle en utilisant Agilent-014879 Whole Genome Rat 4x44K 60mer réseaux d'oligonucléotides (G4131F, Agilent Technologies, Palo Alto, en Californie, NCBI GEO Accession # GPL7294; GSE23093 et ​​GSE29733 qui sont présents à le dépôt NCBI GEO). Les deux parcelles dans la figure graphiquement montrer l'expression en 1) le striatum par rapport au cortex pariétal et 2) la MAV par rapport au cortex pariétal. Il est clair que le striatum et du cortex pariétal sont beaucoup plus étroitement liés les uns aux autres que la MAV. Les données comparant le plexus choroïde avec le MAV sera présenté dans une prochaine publication. Cependant, il est probable que les profils d'expression de la MAV et du plexus choroïde sont plus étroitement liés les uns aux autres qu'ils ne le sont dans le striatum et du cortex pariétal. Figure 2 montre la réponse expression différentielle de gènes à l'hyperthermie (EIH) par rapport à AMPH MAV par rapport à contrôler et l'autre. contenu "> L'expression des gènes de plus de 11.000 gènes avec des symboles officiels de gènes NCBI dans MAV d'animaux témoins ont été comparées à celles enregistrées dans le striatum et du cortex pariétal. Plus de 2000 de ces gènes avaient une expression de 2,5 fois ou plus différant par la MAV par rapport aux deux neurones riches en tissus, et 550 gènes avaient une différence de 10 fois plus grande dans l'expression. Un peu plus de 40% (253) d'entre eux étaient des gènes avec une expression diminuée de 10 fois ou plus dans VAC et étaient liés à la fonction neuronale. Il y avait 343 gènes ayant une expression plus de 10 fois ou plus par rapport à MAV cortex pariétal et le striatum. Cette liste de gènes a été utilisé comme un point de départ permettant de déterminer les gènes avec un enrichissement très élevé dans la MAV. Tableau 1 énumère les gènes présentant supérieure à l'expression de 15 fois par rapport à MAV cortex pariétal et le striatum et les classe par rapport à la fonction. Beaucoup de ces gènes étaient liés au système vasculaire et / ou le système immunitaire. Ces Types de gènes doit être enrichi à environ 5 – à 10 – fois à cause de l'augmentation de la vascularisation artérielle elle-même et présente en son sein. Cependant, même pour les gènes ayant des fonctions générales connues vasculaires, soit une augmentation supérieure à 15 fois indique un enrichissement en MAV. Il y avait aussi nombre de gènes avec de très grandes variations de pliage qui sont: 1) les protéines de la matrice extracellulaire (pas spécifiquement lié au système vasculaire), 2) les transporteurs de soluté et 3) métabolisme des lipides et l'acide rétinoïque. En outre, la croissance de quelques-uns et gène de différenciation ou de facteurs de transcription ont été trouvés. Figure 1. Comparaison de l'expression des gènes dans MAV avec Cortex pariétal et le striatum. Graphique Volcano comparant les niveaux d'expression des gènes de la pariétal et le cortex strié (tracé du haut) et le cortex pariétal et MAV (tracé du bas). Les symboles rouges indiquent les gènes qui sont significativement différentes betwefr régions à p <0,05 et ont une expression différentielle de 1,5 fois ou plus entre les régions. Les symboles noirs représentent des gènes qui ne sont pas significativement différentes entre les régions (p> 0,05) et moins de 1,5 fois différentes dans l'expression. Les symboles indiquent les gènes rose avec une différence de moins de 1,5 fois de l'expression, mais statistiquement significativement différentes à p <0,05. Les symboles jaunes d'identifier les gènes qui ont une expression de 1,5 fois ou plus, mais ce changement n'est pas statistiquement significatif à p <0,05. Abréviations Amphétamine AMPH EIH environnement hyperthermie induite Méninges VAC et associé vasculaire cérébral Norm normothermique contrôle Figure 2. Parcelles Volcano effets de l'hyperthermie et de l'amphétamine sur l'expression des gènes dans VAC. Comparantles niveaux d'expression des gènes dans la MAV après saline, EIH ou AMPH au point 3 h de temps. Les symboles rouges indiquent les gènes qui sont réputés être très différents, tandis que les points noirs / cercles représentent des gènes qui ne sont pas significativement différentes entre les régions. Une analyse statistique supplémentaire a été utilisé pour vérifier que l'expression des différences entre le contrôle et les traitements étaient en fait statistiquement significative. Expression MAV cérébrale Expression NCBI Gene Symboles Spécificité tissu ou d'une fonction déclarée (s) > 50 fois ANXA2 a, Col8a1, Des, ESM1, Glycam1, Kl a, Lect1, Lepr, Lum, MYH11, OGN, Tagln, Thbs2, TNNT2 Vascularisation et coeur > 50 fois CCL19, CD74 a, DEFB1, Lrrc21, Mgl1, MRC1, Msln, Pl.a2g5, PRG4, RT1-Bb, RT1-Da Système immunitaire > 50 fois ADH1, Aebp1, Aldh1a2, Gstm2 L'acide rétinoïque et traitement des lipides > 50 fois Cdh1, COL3A1, COL1A2, Colec12, Cpxm2, Cpz, DCN, Emp3, GPC3, Nupr1, Omd, Pcolce Slamf9, Tmem27, Tspan8 Matrice extracellulaire jonctions cellule-cellule et > 50 fois AQP1, Asgr1, Kcnj13, Slc5a5, Slc6a13, Slc6a20, Slc22a6, Sned1, Ttr Ion & homéostasie Solute > 50 fois AlX3, Cdkn1c, FOXC2, IGFBP2, Ifitm1, Ifitm2, Nkx6-1, OSR1, Prrx2, SFRP1, TBX15. Upk1b, Wisp2, Wnt6 Développement et régulation de la transcription > 50 fois Gpha2, Mfap5, Mpzl2 Plac8, Scgb1c1, Sostdc1, Steap1 Inconnu & Divers De 30 à 50 fois </td> ANXA1 a, Angpt2, C6 a, GJB2, Ptgis, Thbd, TIMP1 Vascularisation et coeur De 30 à 50 fois Casp12, CCL2 CCR1, Cd14, CXCL10, Ifitm3, Klra5, Lgals1, Lgals3, Ms4a4a, Ms4a7, Plscr1, SPP1, Xcl1 Système immunitaire De 30 à 50 fois COL6A3, Cpxm1, Efemp1, Fmod, Mgp, NID2 Matrice extracellulaire jonctions cellule-cellule et De 30 à 50 fois Cp, CUBN, GCGR, S100A6, Scn7a, Sct, Slc4a5, Slc16a11, Slco1a5 Ion et l'homéostasie Solute De 30 à 50 fois Cfd, Ch25h, Crabp2, Rarres2 L'acide rétinoïque et traitement des lipides De 30 à 50 fois BMP6, Casp12, DAB2 Folr1, IGF2, Msx1, Tbx18, TWIST1, Wnt5b Développement et régulation de la transcription De 30 à 50 fois Cela3b, CLN6, C1qtnf7, Copz2, Dhrs7c, Gng11, Prss23, Srpx, Vim Inconnu & Divers De 15 à 30 fois Adm, Angpt1, Angptl2, BGN, un CKLF, CNN1, Cox8h, CTSK, F13a1, GJA5, Klf4, Lox, Lyz, Myl9, Procr, Pros1, RT1-Ba, Serpinb10, Serping1, Serpinf1, TGM2, TNMD, Trim63, Txnip un, Vamp5, Vtn Vascularisation et coeur De 15 à 30 fois Ada a, BST2, Ccl6, CD40, CD68, CNTC, Dap, Faim3, Fkbp9, Fxyd5, FMO1, Glipr1, Ier3, Ifi47, Igsf6, Msc, NFATc4, RT1-Db1, Serpinb1a, TiR4, Tubb6 Système immunitaire De 15 à 30 fois Adamtsl4, COL1A1, CRB3, Dpt, Egfl3, FBN1, FBLN1, FBLN5, Fn1, ITGB4, LAMA2, Lgals3bp, LOXL1, Mfap4, MMP14, Mmp23, PPIC, Serpinh1, TIMP3 Matrice extracellulaire jonctions cellule-cellule et De 15 à 30 fois Cybrd1, Selenbp1, Slc2a4, Slc9a2, Slc13a3, Slc16a4, Slc22a8, Slc22a18 Ion et l'homéostasie Solute De 15 à 30 fois AGPAT2, Bdh2, Cyp26b1, Lpar3, Ltb4dh, OLR1, PON3, RBP1, RBP4 L'acide rétinoïque et traitement des lipides De 15 à 30 fois ATF3, Dkk4, Eya2, Ifitm7, Ltbp1, Mustn1, Nr2f2, ptrf, Sphk1, TGFBI, Tcea3 Tcfap2b, Wnt2b, WNT5A, ZIC1 Développement et régulation de la transcription De 15 à 30 fois Adamts12, Adamtsl3, C1r, Crispld2, Crygn, CYP1B1, dse, ENPEP, Enpp2, Epn3, FLNA, FMO3, GNMT, GPRC5C, HSPB1, KLC3, Krt18, Krt19, Mdk, Mesp1, Ms4a6a, Ms4a6b, Ms4a11, Net1, Pdlim2, Phactr2, PLP2, Ppp1r3b, Pqlc3, Rin3, Spag11, SULT1A1, Tmem106a, Wfikkn2 Inconnu & Divers * Les gènes inclus dans le tableau doit être à la fois l'expression de plus de 15 fois supérieure dans le striatum et Parietal cortex et de 5 fois au-dessus des niveaux de fond. Le plus faible des deux ratios (MAV / striatum ou VAC / cortex pariétal) pour chaque gène a été utilisé pour le regroupement. un des gènes se trouvent dans les cellules endothéliales, mais aussi sans doute jouer un rôle important dans la médiation des réponses immunitaires. Tableau 1. Gènes avec une * 15 fois ou plus l'expression accrue de MAV par rapport à striatum et du cortex pariétal.