Ein Visual Beschreibung der Dissektion der Hirnoberfläche Gefäßsystem und assoziierten Hirnhäute und der Aderhaut Plexus aus Rattenhirn

Obwohl nicht in der Video gezeigt wurden Ratten erste eine Überdosis von 300 mg / kg Pentobarbital gegeben, was zu einer Anästhesie in weniger als 3 min, und dann durch Enthauptung getötet. Ihre Gehirne wurden dann schnell, aber vorsichtig aus dem Schädel entfernt und gekühlt in eiskaltem Kochsalzlösung für 5 min. Es ist wichtig, damit das Gehirn abkühlen dieser Zeitspanne vor Sezieren des MAV so dass der MAV von der Oberfläche der Rinde getrennt werden kann (der Oberseite der Schicht I). Das Hirn wurde dann in den Boden einer Petrischale Glas ruht auf Eis, das voll war (1 cm tief) eiskalter physiologischer Kochsalzlösung oder 0,1 M Natrium-Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung pH = 7,4 gestellt. Alle Präparation wird mit dem Gehirn zum größten Teil in Kochsalzlösung eingetaucht getan. Ein. Die Entfernung der Zirbeldrüse Platzieren des Gehirns dorsalen Seite nach oben (bezogen auf den Boden der Petrischale). Die Zirbeldrüse liegt am kaudalen ventralen Bereich zwischen den beiden Hemisphären nur rostral t liegter Kleinhirn (pineal Vertiefung), und ist direkt unterhalb oder an der Oberfläche der Hirnhaut über der Colliculi. Entfernen Sie die Zirbeldrüse erste mit zwei kleinen gebogenen Spitze Pinzette. Es ist rosa in der Farbe wie der Hirnrinde, wird aber oft in den Resten von Blut und Gefäßen verbleibende vom Gehirn entfernt umgeben. 2. Entfernen des MAV Flip das Gehirn über "upside down" und trennen Sie die A. vertebralis, kleineren Arterien und Meningen für den pons aus der Hirnhaut und Gefäßsystem des Vorderhirns. Entfernen des Vorderhirns MAV wird dann gestartet. Es ist wichtig, ventral beginnen in der Dissektion Prozess. Die großen großen Arterien aus dem Kreis der Willis, Mitte Hirnarterien (MCA) und der vorderen Arterien sind die stärksten und dienen als "Gerüst", mit denen die kleineren oberflächlichen Arterien und Arteriolen des Pia- Membran kann dann aus dem Kortex der Rest der Hirnhaut entfernt werden. Siehe Überprüfung durch Scremin 7 für mErz visuelle Darstellungen und Details der Hirnoberfläche Gefäßsystem. Beginnend mit beiden Hemisphären, verwenden Sie die kleine gebogene Spitze Pinzette die hintere kommunizieren Arterie unmittelbar hinter der A. carotis interna Stelle durchtrennen. So trennt die weitere vorderen und hinteren arteriellen Bäumen des Vorderhirns. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die kontralaterale Hemisphäre. Ergreifen der MCA und der vorderen Arterie mit der Zange, ziehen in einer anterioren-dorsaler Richtung, so dass der MAV Abdecken des ventralen vorderen Kortex (piriformis, Riechtuberkel) über und um den Riechbahn angehoben wird. Dadurch wird ein Großteil der MAV für den vorderen Kortex (vereinzelten und Orbital). Schalten Sie das Gehirn in einem 45 bis 90 ° Winkel zu der Petrischale. Die seitlichen, stärker vordere Bereiche des MAV umgebenden seitlichen kortikalen Regionen (Granulat abgeschottet sekundären somatosensorischen und auditorischen Cortex) kann aus der Rinde durch Ergreifen des MCA und zugehörigen arter befreities und vorsichtig dorsal entlang der Hirnrinde. Falls erforderlich, können die Enden der Zange zum Heben und befreien die großen Arterien aus der Rinde beim Präparieren werden. Entfernen Sie nun die weitere hinteren seitlichen Regionen des MAV. (Beachten Sie, dass es am besten, von einer Hemisphäre zur anderen wechseln während dieser Ernte, um sicherzustellen, dass die MAV kalt und hydratisiert bleibt. Auch wenn der Widerstand bei der Befreiung der MAV aus der Rinde auf einer Hemisphäre Schalter auf der kontralateralen Hemisphäre gestoßen vorübergehend und gehen Sie dann wieder auf den ursprünglichen Hemisphäre später.) Um die am dorsalen Bereiche des MAV umgebenden primären somatosensorischen entfernen und motorischen Kortex des Gehirns drehen dorsalen Seite nach oben (bezogen auf den Boden der Petrischale). Um endlich befreien die MAV aus dem Gehirn, verwenden Sie die Enden der Zange entlang der sagittalen Sinus. Dieser Teil des geernteten MAV kann entweder temporär beibehalten werden in eiskalter Kochsalzlösung bis zur Prüfung und Analyse eingefroren oder für eine spätere Verarbeitung. Oftdie MAV, welche die populärsten posterior / kaudalen Regionen des Kortex (entorhinalen, visuellen und auditiven Kortex meisten caudal) bleibt an der Hirnrinde. Seiner Entnahme wird später im Video, wenn die zwischen dem MAV retrosplenialen Cortex und die über den Colliculi seziert gezeigt. 3. Entfernen der Aderhaut Plexus Positionieren Sie das Gehirn Dorsalseite und halten Sie ihn mit den größeren Pinzette Drücken Sie die kleineren Pinzette nach unten durch die Mittellinie zwischen den Hemisphären und dann die Enden Punktion durch die Rinde und Corpus callosum (≈ -3,3 mm bregma) in der Spitze die Mittellinie des Hippocampus. Verwenden Sie die Zange, um den Kortex mit callosum wegziehen aus dem dorsalen Hippocampus und Septum, Aussetzen meisten der Seitenventrikel. Der Plexus geortet und identifiziert werden durch die rote Wellenlinie Abgrenzung der Hauptverkehrsader, die ihre Länge läuft. Mit den beiden Enden der Zange, um die Seitenwände des dritten ven hebelntricle und vergrößern Sie es am meisten kaudalen Ende (≈ -4,3 mm bregma 8). Mit den kleinen Zange, ziehen Sie dieses Ende des Plexus kostenlos. Dann die sehr Frontzahnbereich zwischen Septum und caudatus / Putamen (die meisten rostral Umfang ≈ 1,6 mm von Bregma) gehen und mit der Zange Vergrößern diesen Abschnitt des Ventrikels und ziehen Sie den Plexus kostenlos. Führen Sie den gleichen Vorgang auf der kontralateralen Hemisphäre, um den zweiten verbleibenden Plexus erhalten. Auch dieses Gewebe kann entweder temporär beibehalten werden in eiskaltem Kochsalzlösung bis zur Prüfung und Analyse oder gefroren für eine spätere Verarbeitung. 4. Beseitigung der verbleibenden MAV im 3. Ventrikel Über der Thalamus und die Colliculi ebenso wie die auf die mehr Caudal Regionen des Cortex einschließlich retrosplenialen, auditiven und visuellen Cortex Entfernen Sie den gesamten Hippocampus aus beiden Hemisphären Aussetzen der MAV über den Thalamus und colliculi. Die Entfernung vondieser Teil des MAV ist viel weniger schwierig als die Entfernung von MAV über den Kortex. Ziehen Sie diesen Teil der MAV frei durch Ergreifen des größeren Gefäßen, die über dem vorderen Teil des Thalamus und vorsichtig kaudal. Das Gefäßsystem an die supra collicular Netzwerk verbunden und liefert Blut in den dorsalen Hippocampus und dorsalen Thalamus Netzwerk. Wegziehen kaudal und allmählich frei die supracollicular Netzwerk bis zum Erreichen der letzten Teile der Schwanzflosse arteriellen Kreis Gefäßsystem. An diesem Punkt muß mehr darauf geachtet werden, alle verbleibenden hinteren ventralen MAV auf der Oberfläche des körnigen retrosplenialen, primären akustischen und visuellen Kortex zu entfernen. Wie bei dem anderen Abschnitt des MAV Abdecken der mehreren vorderen Teile des Cortex, kann dieses Gewebe entweder temporär beibehalten werden in eiskalter Kochsalzlösung bis zur Prüfung und Analyse eingefroren oder für eine spätere Verarbeitung. Ein verbleibender hinteren ventralen MAV mit diesem zweiten MAV Abschnitt geerntet sollte ein entfernt werdend hinzugefügt, um die erste seziert MAV Abschnitt über die Hirnrinde, wenn sie getrennt analysiert werden. 5. Repräsentative Ergebnisse Wenn die Dissektion korrekt ausgeführt wird, sollten die resultierenden MAV Geweben in zwei intakten Entitäten Wiegen etwa 35 bis 45 mg insgesamt sein. Die zunächst seziert MAV Umgebung die meisten der Cortex sollte etwa 25 mg und der MAV für den Thalamus wiegen, sollten colliculi und okzipitalen Kortex wiegen etwa 15 mg. Es sollte leicht rosa in der Farbe von der Restblut im Gefäßsystem. Die bilaterale Plexus choroideus geernteten sollte in zwei intakten Gewebeproben mit jedem Wägevorgang 1 bis 2 mg liegen. Obwohl überschüssiges Wasser aus dem MAV entfernt werden vor der Lagerung oder Verarbeitung mit einem Papiertaschentuch, wie sie in der Linse Reinigung verwendet, um Gewebe zu vermeiden ist es nicht eine gute Idee, um überschüssiges Wasser aus dem seziert Plexus zu entfernen. Abbildung 1 wurde für generierte Vergleichen der Expression profil es in drei Regionen (Striatum, parietalen Kortex und MAV) unter kontrollierten Bedingungen mit Agilent-014.879 Whole Rat Genome 4x44K 60mer Oligonukleotid-Arrays (G4131F, Agilent Technologies, Palo Alto, CA; NCBI GEO Accession # GPL7294; GSE23093 und GSE29733, die anwesend sind, der NCBI GEO-Repository). Die beiden Kurven in der Figur zeigen die Expression bildlich in 1) das Striatum des parietalen Kortex verglichen und 2) der MAV der Parietalkortex verglichen. Es ist klar, dass das Striatum und Parietalkortex viel enger beieinander liegen als der MAV verwandt sind. Die Daten Vergleich der Plexus mit der MAV wird in einer zukünftigen Veröffentlichung vorgelegt. Jedoch ist es wahrscheinlich, dass die Profile in der Expression und MAV Plexus choroideus näher aneinander als sie an das Striatum und Parietalkortex sind verwandt. Abbildung 2 zeigt die differentielle Genexpression als Reaktion auf Hyperthermie (EIH) versus AMPH im Vergleich MAV zu kontrollieren und zu einander. Inhalt "> Die Genexpression von mehr als 11.000 Gene, die mit offiziellen NCBI-Gen Symbole in MAV von Kontrolltieren wurde die im Striatum und parietalen Kortex aufgenommen verglichen. Über 2000 dieser Gene hatten ein 2,5-fach oder mehr unterschiedlichen Ausdruck in der MAV im Vergleich zu den zwei neuronale-reiche Gewebe und 550 Gene hatte eine 10-fach größere Differenz in Ausdruck. Etwas mehr als 40% (253) von diesen waren Gene mit einer verringerten Expression von 10-fach oder mehr in MAV und wurden bzgl. neuronale Funktion. Es gab 343 Genen mit über eine 10-fache oder größer Expression in MAV gegenüber Parietalkortex und Striatum. Diese Liste von Genen als Startpunkt, mit denen wurde verwendet, um Gene mit einer sehr hohen Anreicherung im MAV bestimmen. Tabelle 1 listet die Gene mit mehr als 15-fach, um die Expression in MAV Parietalkortex und Striatum verglichen und kategorisiert sie hinsichtlich Funktion. Viele dieser Gene an das vaskuläre System und / oder das Immunsystem verwandt waren. Diese Types von Genen sollte etwa 5 angereichert werden – bis 10 – fach bis wegen der erhöhten Vaskulatur selbst und Blut darin. Aber auch für Gene mit bekannten allgemeinen vaskulären Funktionen, eine Erhöhung über 15-fach zeigt Anreicherung in MAV. Es gab auch Anzahlen von Genen, die mit sehr großer fach Veränderungen waren: 1) Proteine ​​der extrazellulären Matrix (nicht spezifisch an Vaskulatur Verwandte), 2) gelösten Transportern und 3) Lipid und Retinsäuremetabolismus. Wie gut, einige Wachstum und Differenzierung Gen oder Transkriptionsfaktoren gefunden. Abbildung 1. Vergleich der Genexpression in MAV mit parietalen Kortex und Striatum. Volcano Plot Vergleich der Genexpression des parietalen Kortex und Striatum (oben plot) und dem parietalen Kortex und MAV (unten Plot). Die roten Symbole bezeichnen die Gene, die signifikant betwe sinden Regionen p <0,05 und eine 1,5-fache oder mehr unterschiedliche Expression zwischen den Regionen. Die schwarzen Symbole repräsentieren Gene, die nicht wesentlich zwischen den Regionen unterscheiden (p> 0,05) und weniger als das 1,5-fache, die sich in Ausdruck. Die rosa Symbole zeigen Gene mit weniger als einer 1,5-fachen Unterschied in der Expression, aber statistisch signifikant bei p <0,05. Die gelben Symbole Identifizierung von Genen, die eine 1,5-fache oder mehr Ausdruck haben, aber diese Änderung ist nicht statistisch signifikant bei p <0,05. Abkürzungen AMPH Amphetamin EIH umwelt-induzierte Hyperthermie MAV Hirnhäute und zugehörige zerebrale Gefäßsystem Norm normothermen steuert Abbildung 2. Auswirkungen der Hyperthermie und Amphetamin auf die Genexpression in MAV. Volcano Parzellen verglichenGenexpressionsniveaus im MAV nach Kochsalzlösung, EIH oder AMPH an der 3 hr Zeitpunkt. Die roten Symbole deuten die Gene, die als nicht signifikant unterschiedlich, während die schwarzen Punkte / Kreise Genen, die nicht signifikant zwischen Regionen unterscheiden repräsentieren. Zusätzliche statistische Analyse wurde verwendet, um zu überprüfen, welche die Expression Unterschiede zwischen der Kontrolle und Behandlung in der Tat statistisch signifikant waren. MAV Expression Gehirn Expression NCBI Gene Symbole Tissue Spezifität oder gemeldet Funktion (en) > 50-fach ANXA2 a, Col8a1, Des, ESM1, Glycam1, Kl a, Lect1, LEPR, Lum, MYH11, Ogn, Tagln, Thbs2, TNNT2 Gefäßsystem & Heart > 50-fach CCL19, CD74 a, Defb1, Lrrc21, MGL1, Mrc1, Msln, Pla2g5, PRG4, RT1-Bb, RT1-Da Immune System > 50-fach Adh1, Aebp1, Aldh1a2, GSTM2 Retinsäure & Lipid-Verarbeitung > 50-fach Cdh1, COL3A1, COL1A2, Colec12, Cpxm2, CPZ, DCN, Emp3, GPC3, Nupr1, OMD, Pcolce Slamf9, Tmem27, TSPAN8 Extrazellulären Matrix & Zell-Zell-Verbindungen > 50-fach AQP1, Asgr1, Kcnj13, Slc5a5, Slc6a13, Slc6a20, Slc22a6, Sned1, Ttr Ion & Solute Homöostase > 50-fach AlX3, CDKN1C, FOXC2, IGFBP2, Ifitm1, Ifitm2, Nkx6-1, OSR1, Prrx2, sFRP1, TBX15. Upk1b, Wisp2, Wnt6 Development & Transcription Verordnung > 50-fach Gpha2, Mfap5, Mpzl2 Plac8, Scgb1c1, Sostdc1, Steap1 Unknown & Sonstiges 30 bis 50-fache </td> ANXA1 a, Angpt2, C6 a, GJB2, Ptgis, Thbd, TIMP1 Gefäßsystem & Heart 30 bis 50-fache Casp12, CCL2, Ccr1, CD14, CXCL10 Ifitm3, Klra5, LGALS1, LGALS3, Ms4a4a, Ms4a7, Plscr1, SPP1, XCL1 Immune System 30 bis 50-fache Col6a3, Cpxm1, EFEMP1, Fmod, MGP, NID2 Extrazellulären Matrix & Zell-Zell-Verbindungen 30 bis 50-fache Cp, CUBN, GCGR, S100A6, Scn7a, Sct, Slc4a5, Slc16a11, Slco1a5 Ion & Solute Homöostase 30 bis 50-fache Cfd, CH25H, CRABP2, Rarres2 Retinsäure & Lipid-Verarbeitung 30 bis 50-fache BMP6, Casp12, DAB2 Folr1, Igf2, Msx1, Tbx18, TWIST1, Wnt5b Development & Transcription Verordnung 30 bis 50-fache Cela3b, CLN6, C1qtnf7, Copz2, Dhrs7c, Gng11, Prss23, Srpx, Vim Unknown & Sonstiges 15 bis 30-fache Adm, Angpt1, Angptl2, BGN, Cklf a, CNN1, Cox8h, Ctsk, F13a1, GJA5, Klf4, Lox, Lyz, Myl9, Procr, PROS1, RT1-Ba, Serpinb10, SERPING1, Serpinf1, Tgm2, Tnmd, Trim63, Txnip a, Vamp5, Vtn Gefäßsystem & Heart 15 bis 30-fache Ada a, BST2, Ccl6, CD40, CD68, CTSC, Dap, Faim3, Fkbp9, Fxyd5, FMO1, GLIPR1, IER3, Ifi47, Igsf6, Msc, Nfatc4, RT1-Db1, Serpinb1a, TiR4, Tubb6 Immune System 15 bis 30-fache Adamtsl4, COL1A1, Crb3, Dpt, Egfl3, FBN1, Fbln1, FBLN5, Fn1, ITGB4, Lama2, Lgals3bp, Loxl1, Mfap4, MMP14, Mmp23, PPIC, SERPINH1, TIMP3 Extrazellulären Matrix & Zell-Zell-Verbindungen 15 bis 30-fache Cybrd1, Selenbp1, SLC2A4, Slc9a2, Slc13a3, Slc16a4, Slc22a8, Slc22a18 Ion & Solute Homöostase 15 bis 30-fache AGPAT2, Bdh2, CYP26B1, Lpar3, Ltb4dh, Olr1, PON3, RBP1, RBP4 Retinsäure & Lipid-Verarbeitung 15 bis 30-fache ATF3, DKK4, Eya2, Ifitm7, LTBP1, Mustn1, Nr2f2, PTRF, SphK1, TGFBI, Tcea3 Tcfap2b, Wnt2b, Wnt5a, ZIC1 Development & Transcription Verordnung 15 bis 30-fache Adamts12, Adamtsl3, C1r, Crispld2, Crygn, CYP1B1, DSE, Enpep, Enpp2, Epn3, FLNA, FMO3, GNMT, Gprc5c, HSPB1, Klc3, KRT18, Krt19, MDK, Mesp1, Ms4a6a, Ms4a6b, Ms4a11, Net1, Pdlim2, Phactr2, PLP2, Ppp1r3b, Pqlc3, RIN3, Spag11, SULT1A1, Tmem106a, Wfikkn2 Unknown & Sonstiges * Genes in der Tabelle enthalten sind sowohl mehr als 15-fach über Expression im Striatum und Pariet seinal Cortex und 5-fach über dem Hintergrund Ebenen. Das untere der beiden Verhältnissen (MAV / Striatum oder MAV / parietalen Cortex) für jedes Gen wurde für die Gruppierung verwendet. a Gene werden in Endothelzellen gefunden, aber auch wahrscheinlich eine wichtige Rolle bei der Vermittlung Immunantworten. Tabelle 1. Genes mit einem 15-fach * oder mehr erhöhte Expression in MAV im Vergleich zum Striatum und parietalen Kortex.