Una descrizione visiva della dissezione del sistema vascolare di superficie cerebrale e Meningi associate, e del plesso coroide da cervello di ratto

Sebbene non mostrato nel video, i ratti sono stati dato un sovradosaggio di 300 mg / Kg di pentobarbital, con conseguente anestesia in meno di 3 min, e poi sacrificati per decapitazione. I loro cervelli sono stati poi rapidamente, ma accuratamente rimosso dal cranio e refrigerate gelida soluzione salina normale per 5 min. È importante lasciare raffreddare il cervello per tale intervallo di tempo prima di sezionare il MAV modo che il MAV può essere separata dalla superficie della corteccia (superiore dello strato I). Il cervello è stato quindi posto in fondo di un piatto di vetro Petri riposo su ghiaccio che era completa (1 cm di profondità) del freddo salina normale o di sodio 0,1 M tampone fosfato salino pH = 7,4. Tutta la dissezione è fatto con il cervello per la maggior parte immersa in soluzione salina. 1. Rimozione della ghiandola pineale Posizionare il lato dorsale fino al cervello (corrispondente alla parte inferiore della piastra Petri). La ghiandola pineale si trova in corrispondenza della zona più caudale ventrale tra i due emisferi appena rostrale tegli cervelletto (incavo pineale), ed è appena sotto o sulla superficie delle meningi sul collicolo. Rimuovere la ghiandola pineale prima con due piccole pinze estremità ricurva. E 'di colore rosa come la corteccia, ma è spesso circondata nei resti di sangue e vasi residua dalla rimozione del cervello. 2. La rimozione del MAV Capovolgere il cervello su "testa in giù" e separare l'arteria vertebrale, più piccole arterie e le meningi che coprono il ponte dalle meningi e vascolarizzazione del proencefalo. La rimozione del MAV proencefalo viene avviato. È importante iniziare ventralmente nel processo di dissezione. Grandi arterie principali del circolo di Willis, arterie cerebrale media (MCA) e arterie anteriori sono più forti e servono come "impalcatura" con cui le piccole arterie ed arteriole superficiali del piale membrana può quindi essere rimosso dalla corteccia con il resto delle meningi. Vedi recensione di Scremin 7 per mminerale di rappresentazioni visive e dettagli della superficie vascolare cerebrale. A partire da entrambi gli emisferi, utilizzare le piccole pinze punta piegata a recidere l'arteria comunicante posteriore appena posteriormente alla congiuntura carotide interna. Così, separando gli alberi più anteriore e posteriore arteriosi del proencefalo. Ripetere la stessa procedura per l'emisfero controlaterale. Afferrando la MCA e l'arteria anteriore con le pinze, tirare delicatamente in una direzione antero-dorsale in modo che il MAV copre la corteccia ventrale anteriore (piriforme, tubercolo olfattivo) viene sollevato sopra e intorno il tratto olfattivo. Questo elimina la maggior parte del MAV che copre la parte anteriore della corteccia (cingolata e orbitale). Girare il cervello a 45 a 90 ° al piatto Petri. Le regioni più laterali, anteriori del MAV che circonda le zone laterali corticali (granulare insulare, secondaria somatosensoriale e corteccia uditiva) può essere liberato dalla corteccia afferrando la MCA e associati arterIES e tirando delicatamente dorsalmente lungo la corteccia. Se necessario, le estremità della pinza può essere utilizzato per sollevare e liberare le arterie dalla corteccia durante la dissezione. Ora rimuovere le regioni più posteriori laterali del MAV. (Nota, è meglio passare da un emisfero all'altro durante questo processo di raccolta per garantire che il MAV rimane freddo e idratata. Inoltre, se la resistenza a liberare il MAV dalla corteccia viene rilevato da un interruttore emisfero emisfero controlaterale temporaneamente e poi tornare per l'emisfero originale in seguito.) Per rimuovere le regioni più dorsali del MAV circostanti somatosensoriale primaria e corteccia motoria girare il lato dorsale fino al cervello (corrispondente alla parte inferiore della piastra Petri). Per liberare finalmente la MAV dal cervello, utilizzare le estremità della pinza lungo il seno sagittale. Questa porzione del MAV raccolto può essere sia temporaneamente conservato in soluzione salina ghiacciata fino test e analisi o congelati per la successiva elaborazione. Spessoil MAV che copre le regioni più posteriori / caudale della corteccia (corteccia entorinale uditivo, visivo e più caudale) rimane attaccata alla corteccia. La sua rimozione è illustrato più avanti nel video quando il MAV tra la corteccia retrosplenial e sovrastante le collicolo sono sezionati. 3. La rimozione del plesso coroide Posizionare il lato dorsale del cervello verso l'alto e in posizione con le pinze più grandi Spingere la pinza più piccoli verso il basso attraverso la linea mediana tra gli emisferi e quindi utilizzare le estremità per forare attraverso il corpo calloso corteccia e corpo (≈ -3,3 mm dal bregma) nella parte superiore del la linea mediana dell'ippocampo. Utilizzare le pinze per tirare la corteccia con calloso dal dell'ippocampo dorsale e setto, esponendo la maggior parte del ventricolo laterale. Il plesso coroide può essere localizzato e identificato con la linea ondulata rossa che delimita l'arteria principale che corre la sua lunghezza. Utilizzare le due estremità delle pinze per staccare le pareti laterali del terzo ventricle e ingrandirla nella parte più caudale (≈ -4,3 mm dal bregma 8). Utilizzando le pinze piccole, tirare la fine della coroide libero plesso. Poi vai alla regione molto anteriore tra il setto e caudato / putamen (misura più rostrale, ≈ 1,6 millimetri dal bregma) e con le pinze ingrandire questa sezione del ventricolo e tirare il plesso coroide libero. Eseguire la stessa procedura nell'emisfero controlaterale per ottenere il secondo rimanente plesso coroide. Anche in questo tessuto può essere sia temporaneamente conservato in soluzione salina ghiacciata fino al test e analisi o congelati per la successiva elaborazione. 4. La rimozione del MAV che rimane nel ventricolo 3 ° sovrastante il talamo e il collicolo così come quello sulle Regioni più caudale della corteccia tra cui retrosplenial, corteccia auditiva e visiva Rimuovere l'ippocampo intero entrambi gli emisferi che espongono il MAV sul talamo e collicolo. La rimozione diquesta porzione del MAV è molto meno difficile la rimozione del MAV sulla corteccia. Tirare questa porzione di libera MAV afferrando la vascolarizzazione maggiore sovrastante la porzione anteriore del talamo e tirando delicatamente caudalmente. Questo sistema vascolare è collegato alla rete collicular supra e fornisce il sangue al ippocampo dorsale e rete talamo dorsale. Tirare via caudalmente e gradualmente libera la rete supracollicular fino a raggiungere le ultime porzioni del sistema vascolare caudale circolo arterioso. A questo punto, più cura deve essere presa per rimuovere qualsiasi residuo MAV posteriore sulla superficie ventrale del retrosplenial granulare, uditiva primaria e cortecce visive. Come con l'altra sezione MAV coprire le porzioni più anteriori della corteccia, questo tessuto può essere sia temporaneamente conservato in soluzione salina ghiacciata fino test e analisi o congelati per la successiva elaborazione. Qualsiasi residuo MAV posteriore ventrale raccolti con questa seconda sezione MAV deve essere rimosso und aggiunto alla prima sezione MAV sezionato copre la corteccia se devono essere analizzate separatamente. 5. Risultati rappresentativi Quando la dissezione è eseguita correttamente, i tessuti risultano MAV deve essere in due entità intatti del peso di circa 35-45 mg in totale. Il inizialmente sezionato MAV che circonda la maggior parte della corteccia dovrebbe pesare circa 25 mg e il MAV che copre il talamo, collicolo e corteccia occipitale dovrebbe pesare circa 15 mg. Dovrebbe essere leggermente rosato dal sangue residuo nel sistema vascolare. Il bilaterale plesso coroide raccolta devono essere in due campioni di tessuto intatto con ciascuna del peso di 1 a 2 mg. Anche se l'acqua in eccesso può essere rimosso dal MAV prima della conservazione o trasformazione utilizzando carta velina come quello usato per la pulizia della lente, per evitare la perdita di tessuto non è una buona idea per rimuovere l'acqua in eccesso dal plesso coroide sezionato. Figura 1 è stato generato per confronto profil espressione es in tre regioni (striato, corteccia parietale e MAV) in condizioni di controllo che utilizzano Agilent-014879 Whole Genome Ratto 4x44K 60mer array di oligonucleotidi (G4131F, Agilent Technologies, Palo Alto, CA, NCBI GEO adesione # GPL7294; GSE23093 GSE29733 e che sono presenti in il repository NCBI GEO). I due grafici in figura pittoricamente mostrano l'espressione in 1) striato rispetto alla corteccia parietale e 2) il MAV rispetto alla corteccia parietale. È evidente che il corpo striato e corteccia parietale sono molto più strettamente correlati tra loro rispetto al MAV. I dati di confronto del plesso coroide con il MAV sarà presentato in una futura pubblicazione. Tuttavia, è probabile che i profili di espressione del MAV e plesso coroide sono più strettamente correlati tra loro che sono al corpo striato e corteccia parietale. Figura 2 mostra la risposta differenziale espressione genica di ipertermia (EIH) rispetto AMPH in MAV rispetto per il controllo e l'altro. contenuto "> L'espressione genica di oltre 11.000 geni con simboli ufficiali gene NCBI in MAV di animali di controllo è stato confrontato a quelli registrati nello striato e corteccia parietale. Oltre 2000 di questi geni avevano un'espressione di 2,5 volte o più differenti nel MAV rispetto ai due neuronale tessuti ricchi, e 550 geni hanno una differenza di 10 volte maggiore espressione. poco più del 40% (253) di questi erano geni con espressione diminuita di 10 volte o più in MAV e riguardavano funzione neuronale. C'erano 343 geni con più di una espressione di 10 volte o maggiore rispetto a MAV corteccia parietale e striato. Questa lista di geni è stato utilizzato come punto di partenza con cui determinare i geni con un arricchimento molto elevata nel MAV. Tabella 1 elenca i geni con più espressione di 15 volte nei MAV rispetto corteccia parietale e striato e categorizza con rispetto alla funzione. Molti di questi geni sono stati correlati al sistema vascolare e / o il sistema immunitario. Queste tIPI di geni dovrebbe essere arricchito di circa 5 – 10 – volte a causa del sistema vascolare maggiore stesso e sangue presente al suo interno. Tuttavia, anche per geni con funzioni generali vascolari conosciute, con un incremento superiore a 15 volte indica arricchimento in MAV. C'erano anche numero di geni con variazioni di piegatura molto grandi che erano: 1) proteine ​​della matrice extracellulare (non specificamente correlati ai vasi), 2) trasportatori soluti e 3) metabolismo lipidico e acido retinoico. Inoltre, la crescita pochi e differenziazione genetica o fattori di trascrizione sono stati trovati. Figura 1. Confronto tra l'espressione genica in MAV con la corteccia parietale e nello striato. Trama Vulcano confrontando i livelli di espressione genica della corteccia parietale e nello striato (grafico in alto) e la corteccia parietale e MAV (grafico in basso). I simboli rossi indicano i geni che sono significativamente diversi betweregioni en con p <0.05 e hanno una espressione differenziale di 1,5 volte o superiore tra le regioni. I simboli neri rappresentano i geni che non differiscono in modo significativo tra le regioni (p> 0,05) e sono meno di 1,5 volte diversi per espressione. I simboli rosa indicano geni con meno di 1,5 volte differenza di espressione, ma statisticamente significativa con p <0.05. I simboli gialli identificare i geni che hanno un espressione di 1,5 volte o superiore, ma questo cambiamento non è statisticamente significativa a p <0,05. Abbreviazioni AMPH anfetamine EIH eco-ipertermia indotta Meningi MAV e vascolarizzazione cerebrale associata Norm normotermica controlla Figura 2. Effetti di ipertermia e anfetamine sull'espressione genica in MAV. Trame Volcano confrontolivelli di espressione genica nel MAV dopo salina, EIH o AMPH al punto 3 ore di tempo. I simboli rossi indicano i geni che si ritiene essere molto diversa, mentre i punti neri / cerchi rappresentano i geni che non differiscono in modo significativo tra le regioni. Un'ulteriore analisi statistica è stato utilizzato per verificare che un'espressione differenze tra il controllo e trattamenti erano infatti statisticamente significativa. MAV Expression Expression Cervello NCBI Gene Simboli Specificità tissutale o funzione riportato (s) > 50-fold Anxa2 una, Col8a1, Des, Esm1, Glycam1, un Kl, Lect1, LEPR, Lum, MYH11, OGN, Tagln, Thbs2, TNNT2 Vascolarizzazione & Cuore > 50-fold CCL19, un CD74, DEFB1, Lrrc21, Mgl1, MRC1, Msln, Pla2g5, Prg4, RT1-Bb, RT1-Da Sistema immunitario > 50-fold ADH1, Aebp1, Aldh1a2, GSTM2 Acido retinoico e trasformazione dei lipidi > 50-fold CDH1, COL3A1, COL1A2, Colec12, Cpxm2, CPZ, DCN, Emp3, GPC3, Nupr1, OMD, Pcolce Slamf9, Tmem27, Tspan8 Matrice extracellulare e giunzioni cellula-cellula > 50-fold AQP1, Asgr1, Kcnj13, Slc5a5, Slc6a13, Slc6a20, Slc22a6, Sned1, Ttr Ion & Omeostasi Solute > 50-fold Alx3, CDKN1C, FOXC2, Igfbp2, Ifitm1, Ifitm2, Nkx6-1, OSR1, Prrx2, SFRP1, Tbx15. Upk1b, Wisp2, Wnt6 Sviluppo e regolazione della trascrizione > 50-fold Gpha2, Mfap5, Mpzl2 Plac8, Scgb1c1, Sostdc1, Steap1 Sconosciuto e Varie 30-50-fold </td> ANXA1 una, Angpt2, un C6, GJB2, Ptgis, Thbd, TIMP1 Vascolarizzazione & Cuore 30-50-fold Casp12, CCL2, CCR1, Cd14, CXCL10, Ifitm3, Klra5, Lgals1, Lgals3, Ms4a4a, Ms4a7, Plscr1, SPP1, Xcl1 Sistema immunitario 30-50-fold COL6A3, Cpxm1, Efemp1, Fmod, MGP, Nid2 Matrice extracellulare e giunzioni cellula-cellula 30-50-fold Cp, Cubn, GCGR, S100a6, Scn7a, Sct, Slc4a5, Slc16a11, Slco1a5 Ion & omeostasi Solute 30-50-fold CFD, Ch25h, Crabp2, Rarres2 Acido retinoico e trasformazione dei lipidi 30-50-fold BMP6, Casp12, Dab2, Folr1, Igf2, Msx1, Tbx18, Twist1, Wnt5b Sviluppo e regolazione della trascrizione 30-50-fold Cela3b, Cln6, C1qtnf7, Copz2, Dhrs7c, Gng11, Prss23, Srpx, Vim Sconosciuto e Varie 15-30-fold Adm, Angpt1, Angptl2, BGN, un Cklf, Cnn1, Cox8h, Ctsk, F13A1, GJA5, Klf4, Lox, Lyz, Myl9, procr, PROS1, RT1-Ba, Serpinb10, Serping1, Serpinf1, TGM2, Tnmd, Trim63, Txnip una, Vamp5, Vtn Vascolarizzazione & Cuore 15-30-fold Ada a, Bst2, Ccl6, CD40, CD68, Ctsc, Dap, Faim3, Fkbp9, Fxyd5, Fmo1, Glipr1, Ier3, Ifi47, Igsf6, Msc, Nfatc4, RT1-Db1, Serpinb1a, TiR4, Tubb6 Sistema immunitario 15-30-fold Adamtsl4, COL1A1, CRB3, Dpt, Egfl3, FBN1, Fbln1, Fbln5, Fn1, Itgb4, LAMA2, Lgals3bp, Loxl1, Mfap4, MMP14, Mmp23, Ppic, Serpinh1, TIMP3 Matrice extracellulare e giunzioni cellula-cellula 15-30-fold Cybrd1, Selenbp1, SLC2A4, Slc9a2, Slc13a3, Slc16a4, Slc22a8, Slc22a18 Ion & omeostasi Solute 15-30-fold AGPAT2, Bdh2, Cyp26b1, Lpar3, Ltb4dh, Olr1, PON3, Rbp1, RBP4 Acido retinoico e trasformazione dei lipidi 15-30-fold Atf3, Dkk4, Eya2, Ifitm7, Ltbp1, Mustn1, Nr2f2, Ptrf, Sphk1, TGFBI, Tcea3 Tcfap2b, Wnt2b, Wnt5a, Zic1 Sviluppo e regolazione della trascrizione 15-30-fold Adamts12, Adamtsl3, C1r, Crispld2, Crygn, CYP1B1, Dse, Enpep, Enpp2, Epn3, FLNA, FMO3, Gnmt, Gprc5c, HSPB1, Klc3, Krt18, Krt19, Mdk, Mesp1, Ms4a6a, Ms4a6b, Ms4a11, Net1, Pdlim2, Phactr2, PLP2, Ppp1r3b, Pqlc3, Rin3, Spag11, Sult1a1, Tmem106a, Wfikkn2 Sconosciuto e Varie * I geni inclusi nella tabella deve essere al tempo stesso più di 15 volte l'espressione di sopra nello striato e Parietal corteccia e 5 volte al di sopra dei livelli di fondo. Il più basso dei due rapporti (MAV / striato o MAV / corteccia parietale) per ogni gene è stato utilizzato per il raggruppamento. un geni si trovano in cellule endoteliali, ma anche probabilmente un ruolo importante nel mediare risposte immunitarie. Tabella 1. Geni con un 15-fold * o espressione aumentata in più rispetto al MAV striato e corteccia parietale.