A descrição visual do Dissecção da vasculatura cerebral Superfície e Meninges Associados e plexo coróide do cérebro de um rato

Embora não esteja representado no vídeo, os ratos receberam primeiro uma dose excessiva de 300 mg / kg de pentobarbital, resultando em anestesia, em menos de 3 minutos, e em seguida mortos por decapitação. Os seus cérebros foram rapidamente mas então cuidadosamente removido do crânio e arrefeceu-se com gelo uma solução salina normal durante 5 min. É importante deixar a arrefecer o cérebro para esse período de tempo antes da dissecação do MAV modo que o VAM pode ser separado a partir da superfície do córtex (parte superior da camada I). O cérebro foi então colocado no fundo de uma placa de Petri de vidro repousando sobre gelo que foi completo (1 cm de profundidade) de solução salina gelada normal ou de sódio 0,1 M de tampão fosfato com pH = 7,4 salina. Todos dissecção é feita com o cérebro, na maior parte imersa em solução salina. 1. A remoção da glândula Pineal Colocar-se o cérebro do lado dorsal (em relação à parte inferior da caixa de Petri). A glândula pineal está localizado na região mais caudal ventral entre os dois hemisférios para t apenas rostraisele cerebelo (recesso pineal), e é um pouco abaixo ou na superfície das meninges mais colículo. Remover a glândula pineal primeiro usando duas pinças de ponta pequenos amassados. É na cor rosa, como o córtex, mas é frequentemente cercado de restos de sangue e vasculatura residual de remoção de cérebro. 2. A remoção do MAV Virar o cérebro mais "cabeça para baixo" e separar a artéria vertebral, artérias menores e meninges que recobrem a ponte das meninges e vasculatura do cérebro anterior. A remoção do MAV prosencéfalo é então iniciado. É importante começar ventralmente no processo de dissecação. Grandes artérias principais do círculo de Willis, artérias cerebrais médias (ACM) e artérias anteriores são fortes e servem como "andaimes", pelo qual as artérias menores e arteríolas superficiais da pial membrana pode então ser removido a partir do córtex com o restante das meninges. Ver revisão por Scremin 7 para mrepresentações visuais de minério e detalhes da vasculatura cerebral superfície. Começando com qualquer hemisfério, use a pinça ponta pequenas tortas de cortar a artéria comunicante posterior apenas posterior à conjuntura carótida interna. Assim, separando as árvores mais anterior e posterior arteriais do prosencéfalo. Repita o mesmo processo para o hemisfério contralateral. Segurando a MCA ea artéria anterior com a pinça, puxe-a delicadamente em direção anterior-dorsal para que o MAV cobrindo o ventral anterior do córtex (piriforme, tubérculo olfatório) é levantado sobre e em torno do trato olfativo. Isto remove a maior parte do MAV cobrindo o córtex anterior (cingulado e orbital). Ligue o cérebro em um ângulo de 45 ° a 90 para a placa de Petri. Os laterais, regiões mais anteriores do MAV em torno das regiões laterais corticais (insular granular, somatossensorial secundário e córtex auditivo) pode ser liberado a partir do córtex segurando a MCA e associados arters e puxando dorsalmente ao longo do córtex. Se necessário, as extremidades das pinças pode ser usado para levantar e libertar as principais artérias a partir do córtex durante a dissecção. Agora retire as regiões mais posteriores laterais da MAV. (Nota, é melhor para passar de um a outro hemisfério, durante este processo de colheita para assegurar que a MAV permanece frio e hidratado. Além disso, se a resistência a libertar a partir do córtex MAV é encontrado em um interruptor hemisfério para o hemisfério contralateral temporariamente e depois voltar para o hemisfério original mais tarde.) Para remover as regiões mais dorsais da MAV rodeiam a somatossensorial primário e córtex motor transformar-se o cérebro do lado dorsal (em relação à parte inferior da caixa de Petri). Para finalmente libertar a partir de MAV cerebrais, utilizar as extremidades das pinças ao longo do seio sagital. Esta porção do MAV colhido pode ser mantido temporariamente ou em solução salina arrefecida com gelo até que o teste e a análise ou congelados para posterior processamento. Freqüentementeo MAV cobrindo as regiões mais posteriores / caudal do córtex entorrinal (córtices auditivos, visuais e mais caudal) permanece ligado ao córtex. Sua remoção é mostrado no final do vídeo quando o MAV entre o córtex retrosplenial e sobrepondo-se às colículos são dissecados. 3. A remoção do plexo coróide Coloque o lado do cérebro dorsal-se e mantenha no lugar com a pinça maiores Empurre os fórceps menores através da linha média entre os hemisférios e depois usar as extremidades para perfurar através do corpo caloso córtex e corpus (≈ -3,3 milímetros de bregma) na parte superior do a linha média do hipocampo. Use as pinças para puxar o córtex com callosum longe do hipocampo dorsal e septo, expondo mais do ventrículo lateral. O plexo coróide podem ser localizados e identificados pela linha ondulada vermelha demarcação da artéria principal que executa o seu comprimento. Use as duas pontas das pinças para erguer as paredes laterais do terceiro ventricle e ampliá-lo no final mais caudal (≈ -4,3 milímetros de bregma 8). Usando a pinça pequenos, puxe esta final do plexo coróide livre. Então vá para a região muito anterior entre o septo e caudado / putâmen (extensão mais rostral, ≈ 1,6 milímetros de Bregma) e com a pinça ampliar esta secção do ventrículo e puxar o plexo coróide livre. Execute o mesmo procedimento no hemisfério contralateral para obter a segunda restante do plexo coróide. Novamente, isto pode ser tecido ou mantidos temporariamente em solução salina arrefecida com gelo até que o teste e a análise ou congelados para posterior processamento. 4. A remoção do MAV restante no ventrículo 3 º cobre o tálamo e colículo bem como que sobre as regiões mais caudal do Cortex incluindo Retrosplenial, Auditiva e Visual Cortex Remover todo o hipocampo de ambos os hemisférios, expondo o MAV sobre o tálamo e colículo. A remoção deesta porção da MAV é muito menos difícil do que a remoção de MAV sobre o córtex. Puxe esta parte do livre MAV segurando a maior vascularização que recobre a porção anterior do tálamo e puxando caudalmente. Este vasculatura está ligado à rede coliculares supra e fornece sangue ao hipocampo dorsal de rede e tálamo dorsal. Puxar para fora caudalmente e gradualmente livre da rede supracollicular até alcançar as últimas porções da vasculatura círculo caudal arterial. Neste ponto, mais cuidados devem ser tomados para remover qualquer remanescente MAV posterior ventral na superfície do retrosplenial granular, auditivo primário e córtex visual. Tal como acontece com a outra secção de MAV cobrindo as porções mais anteriores do córtex, este tecido pode ser mantido temporariamente ou em solução salina arrefecida com gelo até que o teste e a análise ou congelados para posterior processamento. Qualquer MAV posterior restante ventral colhidas com esta seção MAV segunda devem ser retirados umad adicionadas à secção MAV primeiro dissecados cobrindo o córtex se estão a ser analisados ​​separadamente. 5. Resultados representativos Quando a dissecção é executada correctamente, os tecidos resultantes MAV devem estar em duas entidades intactos, pesando cerca de 35-45 mg no total. O MAV inicialmente dissecadas circundante a maior parte do córtex deve pesar cerca de 25 mg e a MAV cobrindo o tálamo, o córtex occipital colículos e deve pesar cerca de 15 mg. Deve ser um pouco rosado na cor do sangue residual na vasculatura. O plexo coróide bilateral colhida devem estar em duas amostras de tecidos intactos, pesando cada um com 1 a 2 mg. Embora a água em excesso pode ser removido do MAV antes do armazenamento ou de processamento, usando papel de seda, como a utilizada na limpeza das lentes, a fim de evitar a perda de tecido que não é uma boa ideia para remover o excesso de água a partir do plexo coróide dissecado. Figura 1 foi gerado por comparando profil expressão es em três regiões (estriado, córtex parietal e MAV) em condições de controle usando Agilent-014879 Whole Rat Genome 4x44K 60mer arrays de oligonucleotídeos (G4131F, Agilent Technologies, Palo Alto, CA; NCBI GEO Adesão # GPL7294; GSE23093 e GSE29733 que estão presentes em o NCBI repositório GEO). Os dois gráficos na figura pictoricamente mostrar a expressão em 1) no estriado em relação ao córtex parietal e 2) o MAV relação ao córtex parietal. É claro que o striatum eo córtex parietal são muito mais intimamente relacionada com o outro do que o VAM. Os dados que comparam o plexo coróide com o MAV serão apresentados numa publicação futura. No entanto, é provável que o perfil de expressão do MAV e do plexo coróide são mais estreitamente relacionadas entre si do que são para o striatum eo córtex parietal. Figura 2 mostra a resposta diferencial a expressão do gene para a hipertermia (EIH) versus AMPH em comparação MAV para controlar e cada um dos outros. conteúdo "> A expressão dos genes de mais de 11.000 genes com símbolos oficiais de genes do NCBI em MAV dos animais controle foi comparado ao registrado no estriado e do córtex parietal. Mais de 2000 desses genes tinha uma expressão de 2,5 vezes ou mais diferindo no MAV em comparação com os dois neuronal tecidos ricos, e 550 genes tinham uma diferença de 10 vezes maior em expressão. Ligeiramente mais do que 40% (253) eram genes com expressão diminuída de 10 vezes ou mais em MAV e estavam relacionados com função neuronal. Havia 343 genes com uma sobre expressão de 10 vezes ou mais, em comparação com MAV córtex parietal e striatum. Esta lista de genes foi utilizado como ponto de partida com o qual para determinar genes com um enriquecimento muito elevada na MAV. Tabela 1 lista os genes com maior do que a expressão de 15 vezes em comparação com MAV córtex parietal e corpo estriado e classifica-os em relação à função. Muitos destes genes foram relacionados com o sistema vascular e / ou do sistema imunológico. Estes tIPOS de genes deve ser enriquecido cerca de 5 – a 10 – vezes a causa do aumento da vasculatura e do sangue próprio presente nele. No entanto, mesmo para os genes com funções conhecidas gerais vasculares, um aumento superior a 15 vezes indica enriquecimento em MAV. Havia também um número de genes com grandes alterações de dobragem que eram: 1) proteínas da matriz extracelular de lípidos (não especificamente relacionadas com a vasculatura), 2) os transportadores de soluto e 3) e o metabolismo do ácido retinóico. Como o crescimento, bem poucos e genes de diferenciação ou fatores de transcrição foram encontrados. Figura 1. Comparação da Expressão Gênica em MAV com córtex parietal e estriado. Enredo Vulcão comparando os níveis de expressão gênica do córtex parietal e estriado (gráfico em cima) eo córtex parietal e MAV (gráfico inferior). Os símbolos vermelhos denotam os genes que são significativamente diferentes entre níregiões banho de p <0,05 e têm uma expressão diferencial de 1,5 vezes ou maior entre as regiões. Os símbolos pretos representam os genes que não são significativamente diferentes entre as regiões (p> 0,05) e são menos do que 1,5 vezes na expressão diferentes. Os símbolos indicam genes rosa com uma diferença inferior a 1,5 vezes na expressão, mas uma diferença estatisticamente significativa a p <0,05. Os símbolos amarelos identificar genes que têm uma expressão de 1,5 vezes ou superior, mas esta mudança não é estatisticamente significativa para p <0,05. Abreviaturas Anfetamina AMPH EIH hipertermia induzida ambientalmente Meninges VAM e associado à vasculatura cerebral Norma normotérmica controla Figura 2. Efeitos da hipertermia e anfetamina sobre a expressão gênica no MAV. Parcelas Vulcão comparandoníveis de expressão de genes no MAV depois salino, EIH ou AMPH no ponto de tempo de 3 horas. Os símbolos vermelhos denotam os genes que são considerados significativamente diferentes, enquanto os pontos pretos / círculos representam genes que não diferem significativamente entre as regiões. A análise estatística adicional foi usado para verificar que a expressão diferenças entre o controlo e os tratamentos foram de facto estatisticamente significativa. MAV Expressão Cérebro Expressão Símbolos NCBI Gene Especificidade tecido ou função referida (s) > 50 vezes Anxa2 um, Col8a1, Des, Esm1, Glycam1, Kl um, Lect1, Lepr, Lum, Myh11, OGN, Tagln, Thbs2, TNNT2 Vasculatura & coração > 50 vezes Ccl19, CD74 a, Defb1, Lrrc21, MGL1, MRC1, Msln, Pla2g5, Prg4, RT1-Bb, RT1-Da Sistema Imune > 50 vezes Adh1, Aebp1, Aldh1a2, Gstm2 Ácido retinóico e Processamento de lipídeos > 50 vezes CDH1, COL3A1, COL1A2, Colec12, Cpxm2, CPZ, DCN, Emp3, Gpc3, Nupr1, OMD, Pcolce Slamf9, Tmem27, Tspan8 Extracelulares junções Matrix & célula-célula > 50 vezes AQP1, Asgr1, Kcnj13, Slc5a5, Slc6a13, Slc6a20, Slc22a6, Sned1, Ttr Ion & Homeostase Solute > 50 vezes Alx3, Cdkn1c, FOXC2, IGFBP2, Ifitm1, Ifitm2, Nkx6-1, OSR1, Prrx2, Sfrp1, Tbx15. Upk1b, Wisp2, Wnt6 Desenvolvimento e regulação da transcrição > 50 vezes Gpha2, Mfap5, Mpzl2 Plac8, Scgb1c1, Sostdc1, Steap1 Desconhecido & Diversos 30-50 vezes </td> Anxa1 um, Angpt2, C6 a, GJB2 Ptgis, Thbd, Timp1 Vasculatura & coração 30-50 vezes Casp12, CCL2, CCR1, Cd14, Cxcl10, Ifitm3, Klra5, Lgals1, LGALS3, Ms4a4a, Ms4a7, Plscr1, SPP1, Xcl1 Sistema Imune 30-50 vezes Col6a3, Cpxm1, Efemp1, FMOD, pop, Nid2 Extracelulares junções Matrix & célula-célula 30-50 vezes Cp, Cubn, Gcgr, S100a6, Scn7a, Sct, Slc4a5, Slc16a11, Slco1a5 Ion & homeostase Solute 30-50 vezes Cfd, Ch25h, Crabp2, Rarres2 Ácido retinóico e Processamento de lipídeos 30-50 vezes BMP6, Casp12, Dab2, Folr1, IGF2, Msx1, Tbx18, Twist1, Wnt5b Desenvolvimento e regulação da transcrição 30-50 vezes Cela3b, CLN6, C1qtnf7, Copz2, Dhrs7c, Gng11, Prss23, Srpx, Vim Desconhecido & Diversos 15-30 vezes Adm, Angpt1, Angptl2, BGN, Cklf um, Cnn1, Cox8h, CTSK, F13a1, Gja5, Klf4, Lox, Lyz, Myl9, Procr, PROS1, RT1-Ba, Serpinb10, Serping1, Serpinf1, Tgm2, Tnmd, Trim63, Txnip um, Vamp5, VTN Vasculatura & coração 15-30 vezes Ada um, Bst2, Ccl6, CD40, CD68, CTSC, Dap, Faim3, Fkbp9, Fxyd5, Fmo1, Glipr1, Ier3, Ifi47, Igsf6, Msc, Nfatc4, RT1-DB1, Serpinb1a, TiR4, Tubb6 Sistema Imune 15-30 vezes Adamtsl4, COL1A1, Crb3, DPT, Egfl3, Fbn1, Fbln1, FBLN5, Fn1, ITGB4, LAMA2, Lgals3bp, Loxl1, Mfap4, Mmp14, Mmp23, CIPP, SERPINH1, TIMP3 Extracelulares junções Matrix & célula-célula 15-30 vezes Cybrd1, Selenbp1, Slc2a4, Slc9a2, Slc13a3, Slc16a4, Slc22a8, Slc22a18 Ion & homeostase Solute 15-30 vezes AGPAT2, Bdh2, Cyp26b1, Lpar3, Ltb4dh, Olr1, Pon3, Rbp1, RBP4 Ácido retinóico e Processamento de lipídeos 15-30 vezes Atf3, Dkk4, Eya2, Ifitm7, Ltbp1, Mustn1, Nr2f2, ptrf, Sphk1, Tgfbi, Tcea3 Tcfap2b, Wnt2b, Wnt5a, Zic1 Desenvolvimento e regulação da transcrição 15-30 vezes Adamts12, Adamtsl3, C1r, Crispld2, Crygn, CYP1B1, DSE, Enpep, Enpp2, Epn3, Flna, FMO3, Gnmt, Gprc5c, Hspb1, Klc3, Krt18, Krt19, MDK, Mesp1, Ms4a6a, Ms4a6b, Ms4a11, Net1, Pdlim2, Phactr2, PLP2, Ppp1r3b, Pqlc3, Rin3, Spag11, Sult1a1, Tmem106a, Wfikkn2 Desconhecido & Diversos * Genes incluídos na tabela deve ser tanto a expressão mais de 15 vezes acima do estriado e PARIETal córtex e de 5 vezes acima dos níveis de fundo. Quanto mais baixa das duas taxas (MAV / estriado ou MAV / córtex parietal) para cada gene foi usado para agrupamento. um Genes são encontradas nas células endoteliais, mas também provavelmente desempenham um papel importante na mediação de respostas imunes. Tabela 1. Genes com uma * 15 vezes ou mais a expressão aumentada em comparação com MAV striatum eo córtex parietal.