Una descripción visual de la disección de la vasculatura cerebral superficial y las meninges asociada y el plexo coroideo del cerebro de rata

Aunque no se muestra en el vídeo, las ratas se les dio primero una sobredosis de 300 mg / kg de pentobarbital, lo que resulta en la anestesia en menos de 3 min y, a continuación sacrificaron por decapitación. Sus cerebros fueron luego rápidamente pero cuidadosamente retirados del cráneo y se enfrió en hielo frío solución salina normal durante 5 min. Es importante dejar que el cerebro fresco para esta cantidad de tiempo antes de la disección de la MAV, para que la MAV se puede separar de la superficie de la corteza (la parte superior de la capa I). El cerebro se colocó en el fondo de un plato de Petri de vidrio que descansa sobre hielo que estaba lleno (1 cm de profundidad) de helado de solución salina normal o de sodio 0,1 M de buffer fosfato salino pH = 7,4. Toda la disección se realiza con el cerebro en su mayor parte sumergió en solución salina. 1. Extirpación de la Glándula Pineal Coloque el cerebro hasta el lado dorsal (con relación a la parte inferior de la placa de Petri). La glándula pineal se encuentra en la región ventral más caudal entre los dos hemisferios sólo rostral a tél cerebelo (rebaje pineal), y está justo por debajo o en la superficie de las meninges más de los colículos. Retire la glándula pineal primero con dos pequeñas pinzas de punta dobladas. Es de color rosa como la corteza, pero es a menudo rodeada de restos de sangre y la vasculatura residual de la extracción del cerebro. 2. La eliminación de la MAV Da la vuelta al cerebro a través del "boca abajo" y separar la arteria vertebral, las pequeñas arterias y las meninges que cubren el puente de las meninges y la vasculatura del cerebro anterior. La eliminación de la MAV cerebro anterior es iniciada. Es importante comenzar ventralmente en el proceso de disección. Las grandes arterias principales del polígono de Willis, arterias cerebral media (MCA) y las arterias anteriores son los más fuertes y servir como "andamios" por la cual las arterias pequeñas y arteriolas superficiales del pial membrana puede entonces ser retirado de la corteza con el resto de las meninges. Consulte la opinión de Scremin 7 para mrepresentaciones visuales de mineral y los detalles de la vasculatura cerebral superficie. A partir de cualquiera de los hemisferios, utilizar las pinzas dobladas pequeñas puntas para cortar la arteria comunicante posterior justo posterior a la unión carótida interna. Por lo tanto, la separación de los árboles arteriales más anterior y posterior del cerebro anterior. Repetir el mismo proceso para el hemisferio contralateral. Agarrando la MCA y la arteria anterior con las pinzas, tirar suavemente en una dirección anterior-dorsal para que el MAV que cubre la corteza anterior ventral (piriforme, tubérculo olfatorio) se eleva por encima y alrededor del tracto olfatorio. Esto elimina gran parte de la MAV que cubre la corteza anterior (cingulado y orbital). Girar el cerebro en un ángulo de 45 ° a 90 a la placa de Petri. Las regiones laterales, más anterior de la MAV que rodea a las regiones corticales laterales (granular insular, secundaria somatosensorial y la corteza auditiva) puede ser liberado de la corteza agarrando la MCA y arterias asociadoies y tirando suavemente dorsalmente a lo largo de la corteza. Si es necesario, los extremos de las pinzas se pueden utilizar para levantar y liberar las arterias principales de la corteza durante la disección. Ahora quite las regiones más laterales posteriores de la MAV. (Nota, es mejor cambiar de un hemisferio al otro durante este proceso de cosecha para asegurar que la MAV permanece frío e hidratado. Además, si la resistencia en la liberación de la MAV de la corteza se encuentra en el interruptor de un hemisferio con el hemisferio contralateral temporalmente y luego volver al hemisferio original más adelante.) Para eliminar las regiones más dorsales de la MAV que rodean la somatosensorial primaria y la corteza motora gire el cerebro hasta el lado dorsal (con relación a la parte inferior de la placa de Petri). Para liberar finalmente el Mav cerebro, utilice los extremos de las pinzas a lo largo del seno sagital. Esta porción de la MAV cosechada puede ser guardado temporalmente en solución salina enfriada con hielo hasta que las pruebas y el análisis o congelado para su posterior procesamiento. A menudola MAV que cubre las regiones más posteriores / caudal de la corteza (corteza entorrinal auditivas, visuales y más caudal) permanece unida a la corteza. Su eliminación se muestra más adelante en el video cuando el MAV entre la corteza y retrosplenial que recubre los colliculi se disecan. 3. La eliminación del plexo coroideo Coloque el lado dorsal del cerebro y mantenerlo en su lugar con las pinzas más grandes Presione las pinzas más pequeñas a lo largo de la línea media entre los hemisferios y luego utilice los extremos para perforar a través del cuerpo calloso y la corteza corpus (≈ -3,3 mm de bregma) en la parte superior de la línea media del hipocampo. Use las pinzas para tirar de la corteza con calloso lejos del hipocampo dorsal y el tabique, exponiendo la mayor parte del ventrículo lateral. El plexo coroideo puede ser localizado e identificado por la línea ondulada de color rojo demarcación de la arteria principal que recorre su longitud. Usa los dos extremos de las pinzas para arrancar las paredes laterales de la tercera ventricle y ampliarla en el extremo más caudal (≈ -4,3 mm de bregma 8). Uso de las pequeñas pinzas, tire de este extremo del plexo coroideo libre. Luego vaya a la región muy anterior entre el tabique y el caudado / putamen (extensión más rostral, ≈ 1,6 mm de bregma) y con las pinzas ampliar esta sección del ventrículo y tire del plexo coroideo libre. Realice el mismo procedimiento en el hemisferio contralateral al obtener el segundo plexo coroideo restante. De nuevo este tejido puede ser guardado temporalmente en solución salina enfriada con hielo hasta que las pruebas y el análisis o congelado para su posterior procesamiento. 4. La eliminación de la MAV que queda en el 3 º ventrículo Cubriendo el tálamo y el colículo así como en las regiones más caudal de la corteza como retroesplenial, auditivo y corteza visual Quite todo el hipocampo de ambos hemisferios exponiendo la MAV en el tálamo y colículo. La eliminación de losesta parte de la MAV es mucho menos difícil que la eliminación de MAV sobre la corteza. Tire de esta parte de la MAV libre agarrando la vasculatura más grande que recubre la parte anterior del tálamo y tirando suavemente en sentido caudal. Esta vasculatura está conectado a la red collicular supra y suministra sangre al hipocampo dorsal y de la red tálamo dorsal. Tire a la basura caudalmente y libre poco a poco la red supracollicular hasta llegar a las últimas porciones de la vasculatura arterial círculo caudal. En este punto, más se debe tener cuidado para eliminar cualquier resto de MAV ventral posterior en la superficie de la retroesplenial granular, auditiva primaria y cortezas visuales. Al igual que con la otra sección de MAV cubriendo las porciones más anterior de la corteza, este tejido puede ser guardado temporalmente en solución salina enfriada con hielo hasta que las pruebas y el análisis o congelado para su posterior procesamiento. Cualquier remanente MAV posterior ventral cosechado con esta segunda sección MAV se debe quitar unad añadido a la sección de MAV primera diseccionado que cubre la corteza si han de ser analizados por separado. 5. Los resultados representativos Cuando la disección se realiza correctamente, los tejidos resultantes MAV deben estar en dos entidades intactas pesan alrededor de 35 a un total de 45 mg. El inicialmente diseccionado MAV que rodea la mayor parte de la corteza debe pesar aproximadamente 25 mg y la MAV que cubre el tálamo, el colículo y corteza occipital debe pesar aproximadamente 15 mg. Debe ser un poco de color rosado de la sangre residual en la vasculatura. El plexo coroideo bilateral cosechados deben estar en dos muestras de tejido intacto con un peso cada 1 a 2 mg. Aunque el exceso de agua puede eliminarse de la MAV antes de su almacenamiento o procesamiento con el uso del papel tejido tal como el utilizado en la limpieza de la lente, para evitar la pérdida de tejido que no es una buena idea para eliminar el exceso de agua de la coroides diseccionado plexo. Figura 1 se ha generado para comparando profil expresión es en tres regiones (cuerpo estriado, la corteza parietal y MAV) bajo condiciones de control usando Agilent-014879 enteros Rat Genome 4x44K 60mer matrices de oligonucleótidos (G4131F, Agilent Technologies, Palo Alto, CA; NCBI GEO n º de acceso GPL7294; GSE23093 y GSE29733 que están presentes en el NCBI GEO repositorio). Los dos gráficos en la figura gráficamente muestran la expresión en 1) el cuerpo estriado en comparación con la corteza parietal y 2) la MAV en comparación con la corteza parietal. Es evidente que el cuerpo estriado y la corteza parietal son mucho más estrechamente relacionados entre sí que la MAV. Los datos que comparan el plexo coroideo con la MAV se presenta en una publicación futura. Sin embargo, es probable que los perfiles de expresión en la MAV y el plexo coroideo están más estrechamente relacionados entre sí que lo son para el cuerpo estriado y la corteza parietal. Figura 2 muestra la expresión diferencial de genes de respuesta a la hipertermia (EIH) versus AMPH en comparación MAV para controlar y entre ellos. contenido "> La expresión de genes de más de 11.000 genes con los oficiales símbolos de genes NCBI en MAV de animales de control se comparó con los registrados en el cuerpo estriado y la corteza parietal. Más de 2000 de estos genes tenían una expresión de 2,5 veces o más diferentes en el MAV en comparación con los dos neuronal tejidos ricos, y 550 genes tenían una diferencia de 10 veces mayor en la expresión. Algo más del 40% (253) de éstos eran genes con una expresión disminuida de 10-veces o más en MAV y estaban relacionadas con la función neuronal. Hubo 343 genes con una expresión más de 10-veces o más en comparación con MAV corteza parietal y el cuerpo estriado. Esta lista de genes se utilizó como punto de partida con el cual determinar los genes con un enriquecimiento muy alto en la MAV. Cuadro 1 se enumeran los genes con una mayor expresión de 15-veces en comparación con MAV corteza parietal y el cuerpo estriado y las clasifica con respecto a la función. Muchos de estos genes estaban relacionados con el sistema vascular y / o el sistema inmune. Estos tipos de genes debe ser enriquecida sobre 5 – a 10 – veces a causa del aumento de la vasculatura en sí y la sangre presente en ella. Sin embargo, incluso para los genes con funciones conocidas vasculares generales, un aumento por encima de 15-veces indica un enriquecimiento en MAV. También había un número de genes con cambios veces muy grandes que eran: 1) proteínas de la matriz extracelular (no específicamente relacionados con la vasculatura), 2) transportadores de soluto y 3) los lípidos y el metabolismo del ácido retinoico. Dado que el crecimiento así, pocos y diferenciación genética o factores de transcripción se encontraron. Figura 1. Comparación de la Expresión Génica en MAV con la corteza parietal y el cuerpo estriado. Parcela Volcán comparar los niveles de expresión génica de la corteza parietal y el cuerpo estriado (gráfica superior) y la corteza parietal y MAV (diagrama de abajo). Los símbolos rojos denotan los genes que son significativamente diferentes betwebaño regiones de p <0,05 y tienen una expresión diferencial de 1,5 veces o más entre las regiones. Los símbolos negros representan los genes que no difieren significativamente entre las regiones (p> 0,05) y están a menos de 1,5-veces difieren en la expresión. Los símbolos indican los genes de color rosa con menos de una diferencia de 1,5-veces en la expresión pero estadísticamente diferentes de manera significativa a p <0,05. Los símbolos amarillos identificar los genes que tienen una expresión 1,5-veces o más, pero este cambio no es estadísticamente significativa a p <0,05. Abreviaturas AMPH anfetamina EIH ambientalmente hipertermia inducida MAV meninges y la vasculatura cerebral asociada Norma normotérmica controla Figura 2. Efectos de la hipertermia y la anfetamina sobre la expresión de genes en MAV. Volcán compararon parcelaslos niveles de expresión génica en el MAV después salina, o EIH AMPH en el punto 3 hr tiempo. Los símbolos rojos indican los genes que se consideran significativamente diferentes, mientras que los puntos negros / círculos representan los genes que no difieren significativamente entre regiones. Análisis estadístico adicional se utilizó para verificar que la expresión de las diferencias entre el control y los tratamientos eran de hecho estadísticamente significativa. Expresión MAV cerebral Expresión NCBI Gene símbolos Especificidad tejido o función informado (s) > 50-veces ANXA2 a, Col8a1, Des, Esm1, Glycam1, Kl a, Lect1, Lepr, Lum, MYH11, Ogn, Tagln, Thbs2, TNNT2 Vasculatura y corazón > 50-veces CCL19, una CD74, DEFB1, Lrrc21, Mgl1, Mrc1, Msln, Pl.a2g5, PRG4, RT1-Bb, RT1-Da Sistema Inmune > 50-veces Adh1, Aebp1, Aldh1a2, GSTM2 El ácido retinoico y procesamiento de los lípidos > 50-veces Cdh1, COL3A1, COL1A2, Colec12, Cpxm2, CPZ, DCN, Emp3, GPC3, Nupr1, OMD, Pcolce Slamf9, Tmem27, Tspan8 Matriz extracelular y uniones célula-célula > 50-veces AQP1, Asgr1, Kcnj13, Slc5a5, Slc6a13, Slc6a20, Slc22a6, Sned1, Ttr Ion y homeostasis de solutos > 50-veces Alx3, CDKN1C, FOXC2, IGFBP2, IFITM1, Ifitm2, Nkx6-1, OSR1, Prrx2, SFRP1, Tbx15. Upk1b, Wisp2, Wnt6 Desarrollo y regulación de la transcripción > 50-veces Gpha2, Mfap5, Mpzl2 Plac8, Scgb1c1, Sostdc1, Steap1 Desconocido y Otros 30 a 50 veces </td> ANXA1 a, Angpt2, C6 a, GJB2, Ptgis, Thbd, TIMP1 Vasculatura y corazón 30 a 50 veces Casp12, CCL2, CCR1, CD14, CXCL10, Ifitm3, Klra5, Lgals1, Lgals3, Ms4a4a, Ms4a7, Plscr1, Spp1, Xcl1 Sistema Inmune 30 a 50 veces COL6A3, Cpxm1, Efemp1, FMod, pop, NID2 Matriz extracelular y uniones célula-célula 30 a 50 veces Cp, CUBN, GCGR, S100A6, Scn7a, SCT, Slc4a5, Slc16a11, Slco1a5 Ion y homeostasis de solutos 30 a 50 veces CFD, Ch25h, CRABP2, Rarres2 El ácido retinoico y procesamiento de los lípidos 30 a 50 veces BMP6, Casp12, Dab2, Folr1, Igf2, MSX1, Tbx18, TWIST1, Wnt5b Desarrollo y regulación de la transcripción 30 a 50 veces Cela3b, Cln6, C1qtnf7, Copz2, Dhrs7c, Gng11, Prss23, Srpx, Vim Desconocido y Otros 15 a 30 veces Adm, Angpt1, Angptl2, BGN, Cklf a, cnn1, Cox8h, CTSK, F13a1, GJA5, Klf4, Lox, Lyz, Myl9, PROCR, PROS1, RT1-Ba, Serpinb10, Serping1, Serpinf1, TGM2, Tnmd, Trim63, Txnip a, Vamp5, VTN Vasculatura y corazón 15 a 30 veces Ada a, Bst2, Ccl6, CD40, CD68, CTSC, Dap, Faim3, Fkbp9, Fxyd5, Fmo1, Glipr1, IER3, Ifi47, Igsf6, Msc, NFATc4, RT1-DB1, Serpinb1a, TiR4, Tubb6 Sistema Inmune 15 a 30 veces Adamtsl4, COL1A1, CRB3, DPT, Egfl3, Fbn1, FBLN1, FBLN5, FN1, ITGB4, Lama2, Lgals3bp, LOXL1, Mfap4, MMP14, Mmp23, PPIC, Serpinh1, TIMP3 Matriz extracelular y uniones célula-célula 15 a 30 veces Cybrd1, Selenbp1, SLC2A4, Slc9a2, Slc13a3, Slc16a4, Slc22a8, Slc22a18 Ion y homeostasis de solutos 15 a 30 veces AGPAT2, Bdh2, Cyp26b1, Lpar3, Ltb4dh, Olr1, PON3, RBP1, RBP4 El ácido retinoico y procesamiento de los lípidos 15 a 30 veces ATF3, Dkk4, Eya2, Ifitm7, Ltbp1, Mustn1, Nr2f2, PTRF, Sphk1, TGFBI, Tcfap2b Tcea3, Wnt2b, Wnt5a, Zic1 Desarrollo y regulación de la transcripción 15 a 30 veces Adamts12, Adamtsl3, C1r, Crispld2, Crygn, CYP1B1, DSE, ENPEP, Enpp2, Epn3, FLNA, FMO3, GNMT, Gprc5c, HSPB1, Klc3, KRT18, Krt19, MDK, Mesp1, Ms4a6a, Ms4a6b, Ms4a11, NET1, Pdlim2, Phactr2, PLP2, Ppp1r3b, Pqlc3, Rin3, SPAG11, SULT1A1, Tmem106a, Wfikkn2 Desconocido y Otros * Los genes incluidos en la tabla debe ser tanto la expresión por encima de más de 15-veces en el cuerpo estriado y Parietal córtex y 5-veces por encima de los niveles de fondo. La menor de las dos relaciones (MAV / estriado o MAV / corteza parietal) para cada gen se utiliza para la agrupación. unos genes se encuentran en las células endoteliales sino también probablemente juegan un papel importante en la mediación de la respuesta inmune. Tabla 1. Los genes con un * 15-veces o más mayor expresión en MAV comparación con el cuerpo estriado y la corteza parietal.