الإنتاج الضخم ل Aedes aegypti المعدلة وراثيا للإصدارات الميدانية في البرازيل
Summary
لتحقيق قمع السكان من Aedes aegypti باستخدام نظامRIDL ® (إطلاق الحشرات التي تحمل القاتل المهيمن) ، تحتاج إلى إطلاق أعداد كبيرة من البعوض الذكور. وهذا يتطلب استخدام تقنيات وتكنولوجيا تربية الكتلة لتوفير أنظمة موثوقة للحصول على أكبر عدد ممكن من البعوض الذكور عالية الجودة.
Abstract
ويجري السعي إلى تقنيات وأساليب جديدة في محاولة لكسب المعركة ضد البعوض. وقد أدت التطورات الأخيرة في التقنيات الجزيئية إلى تطوير أساليب جديدة ومبتكرة لمكافحة البعوض تقوم على تقنية الحشرات العقيمة (SIT)1-3. أسلوب مكافحة المعروفة باسم RIDL (إطلاق الحشرات التي تحمل المهيمنة القاتلة)4، ويستند حول SIT ، ولكن يستخدم أساليب وراثية لإزالة الحاجة إلى التعقيم الإشعاعي5-8. تم اختبار سلالة RIDL من Ae. aegypti بنجاح في الميدان في جزيرة كايمان الكبرى9,10; ومن المقرر استخدام المزيد من الحقول أو يجري العمل في بلدان أخرى في جميع أنحاء العالم.
وقد تم إنشاء تربية جماعية للحشرات في العديد من أنواع الحشرات ومستويات المليارات في الأسبوع. ومع ذلك، في البعوض، تم إجراء التربية بشكل عام على نطاق أصغر بكثير، مع إجراء معظم التربية على نطاق واسع في السبعينيات والثمانينيات. لبرنامج RIDL من المستحسن الإفراج عن عدد قليل من الإناث ممكن لأنها لدغة ونقل المرض. في برنامج تربية جماعي هناك عدة مراحل لإنتاج الذكور ليتم إطلاقها: إنتاج البيض، وتربية البيض حتى pupation، ومن ثم فرز الذكور من الإناث قبل الإفراج عنهم. ثم يتم استخدام هذه الذكور لبرنامج التحكم RIDL، وأفرج عنه إما الخوادر أو البالغين11،12.
لقمع السكان البعوض باستخدام RIDL عدد كبير من البالغين الذكور عالية الجودة تحتاج إلىتربية 13,14. فيما يلي وصف لأساليب تربية كتلة OX513A، سلالة RIDL من Ae. aegypti 8، للإفراج عنها ويغطي التقنيات اللازمة لإنتاج البيض وتربية الذكور RIDL الشامل لبرنامج التحكم.
Introduction
ينقل البعوض العديد من مسببات الأمراض التي يمكن أن تسبب مجموعة من الأمراض في البشر ، وكانت السيطرة على هذه البعوض معركة مستمرة لعدة قرون. وقد حققت استراتيجيات مكافحة الحشرات القائمة على الأساليب الكيميائية والبيولوجية بعض النجاحات الملحوظة، ولكن في كثير من الحالات لم تكن المكافحة مستدامة على المدى الطويل. على سبيل المثال، حققت البرازيل القضاء على Ae. aegypti في الخمسينات ولكن البعوضة قد تكاثرت مرة أخرى على مدى السنوات ال 40-50 الماضية. ويمكن أن يعزى ذلك إلى العديد من الأسباب، بما في ذلك مقاومة المبيدات الحشرية، والأضرار البيئية، وسوء تنفيذ برنامجالمكافحة 15-20،وإعادة التغلغل السريع دون رصد أو استجابة كافية.
ويجري البحث عن تقنيات وأساليب جديدة في محاولة لكسب هذه المعركة ضد البعوض. وقد أدت التطورات الأخيرة في التقنيات الجزيئية إلى تطوير أساليب جديدة ومبتكرة لمكافحة البعوض تقوم على تقنية الحشرات العقيمة (SIT)1-3. تعتمد طريقة التحكم المعروفة باسم RIDL (إطلاق الحشرات التي تحمل قاتلة مهيمنة)4 على SIT ، ولكنها تستخدم أساليب جينية لإزالة الحاجة إلى التعقيم الإشعاعي. وقد تم بناء سلالات RIDL للعديد من أنواع الآفات بما في ذلك Ae. aegypti 5-8، تم اختبار سلالة RIDL من Ae. aegypti بنجاح في هذا المجال في كايمان الكبرى9،10؛ ومن المقرر استخدام المزيد من الحقول أو يجري العمل في بلدان أخرى في جميع أنحاء العالم. قمع مجموعات البعوض باستخدام RIDL سيتطلب عددا كبيرا من البالغين الذكور عالية الجودة لتربية3,14.
لبرنامج SIT يعتبر من المرغوب فيه للافراج عن الذكور فقط; البعوض الإناث لدغة ونقل المرض. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يكون الذكور المعقمة المفرج عنها “مشتتة” من قبل الإناث المفرج عنهم مما يقلل من فعالية البرنامج. وقد تبين أن إطلاق سراح الذكور فقط لتكون 3-5 أضعاف أكثر فعالية من إطلاق سراح مختلط الجنس في التجارب الميدانية الكبيرة مع ذباب الفاكهة البحر الأبيض المتوسطالمشعع 21.
في برنامج تربية الكتلة RIDL، وهناك عدة مراحل لإنتاج الذكور للإفراج عنهم. الأول هو إنتاج البيض المطلوب لتوليد الافراج (الشكل 1). المرحلة التالية هي تربية البيض إلى الخوادر أو البالغين ، وفصل اليرقات عن الخوادر والجرو الذكر من الخوادر الأنثوية. يتطلب الفصل الواسع النطاق بين الذكور والإناث فرقا بين الجنسين في مرحلة حياة معينة مناسبة لفرز الكتلة22. في Ae. aegypti (وغيرها من أنواع البعوض) هناك فرق كبير في الحجم بين الخوادر الذكور والإناث التي يمكن استغلالها لتقنيات الفصل بين الجنسين. ثم يتم تحرير الذكور RIDL فرزها في برنامج التحكم إما الخوادر أو كبالغين11,12.
فيما يلي وصف أساليب تربية كتلة OX513A، سلالة RIDL من Ae. Aegypti، للإفراج عنهم. وتغطي الأساليب الموصوفة التقنيات اللازمة لإنتاج البيض والذكور RIDL لبرنامج التحكم.
Protocol
Representative Results
Discussion
RIDL هو وسيلة فعالة وآمنة بيئيا لمكافحة البعوض3,29-31. وتنطبق هذه التقنية على برنامج متكامل لإدارة الآفات، وتتوافق معظم أساليب المكافحة الحالية، بما في ذلك مبيدات اليرقات والحد من مواقع التكاثر ومبيدات البالغين مع هذه التكنولوجيا. توضح هذه الطريقة كيفية إنتاج ما يصل إلى 570,000 من الخوادر الذكور من RIDL أسبوعيا لاستخدامها في التحكم في Ae. Aegypti وعلى حد علمنا هذا هو الوصف الأول لإنتاج البعوض المعدل وراثيا على هذا النطاق. تم تطوير بعض أنظمة الإنتاج المماثلة لنوع البرية Ae. aegypti في 1960s و 70s25، ولكن لم يكن هناك إنتاج مماثل على هذا النطاق منذ ذلك الحين. وفي البرازيل، أطلق سراح نحو 11 مليون ذكر في الفترة من شباط/فبراير 2011 إلى شباط/فبراير 2012. وتعتمد أعداد الذكور المطلوب السيطرة عليها في منطقة معينة على عدد من العوامل بما في ذلك حجم السكان البريين، وتشتت الذكور المفرج عنهم، والقدرة التنافسية للذكور على البقاء والتزاوج بعد الإفراج عنهم، والظروف البيئية. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن RIDL يمكن أن تقلل من عدد البعوض بنسبة 80٪ على الأقل9.
هناك حاجة إلى توازن بين تحسين تربية الكتلة لحجم الإنتاج والتكلفة مقابل جودة الذكور. على سبيل المثال ، يمكن أن تزيد كثافة اليرقات المتزايدة من القدرة الإنتاجية عن طريق تقليل المساحة المطلوبة والعمل والوقت إلى pupation32. ومع ذلك ، يمكن أن تؤدي الكثافات العالية جدا من اليرقات إلى ذكور أصغر وأقصر عمرا مع انخفاض قدرة التزاوج32،33. سيتم تقييم جودة الذكور فيما يتعلق ببرنامج SIT في نهاية المطاف من خلال قدرة الذكور المفرج عنهم على التزاوج مع الإناث في الميدان. ويلزم إجراء تقييم ميداني واسع النطاق لتقييم القدرة التنافسية للتزاوج مقارنة بنظرائها البريين10 9. وهذا غالبا ما يجعل من غير العملي تقييم العوامل التي تجعل البعوض الذكور “عالي الجودة” بالضبط. ومع ذلك، فإن الحفاظ على الإنتاج والجودة المتسقين (بالقدر الذي يمكن تقييمه بشكل روتيني) في تربية الكتلة على نطاق واسع أمر بالغ الأهمية. ويتطلب ذلك مستوى عاليا من اليقظة والتوحيد القياسي لجميع العمليات مع احتمال أن يكون للتقلبات الصغيرة تأثير كبير. يعد الاقتباس من يرقات L1 خطوة حاسمة ويوضح هذه النقطة. يعد نقل العدد الصحيح من اليرقات إلى صواني أمرا ضروريا لإنتاج ذات نوعية جيدة. نظام التغذية مصمم خصيصا لعدد محدد من اليرقات. سيؤدي عدد قليل جدا / العديد من اليرقات إلى الإفراط في / تحت التغذية ، مما يؤثر على بقاء اليرقات وحجم الخوادر والوقت للجراء. إذا كان هناك سر لفن تربية الشامل هو ضمان العديد من الخطوات الصغيرة في دورة الإنتاج تجري باستمرار، على وجه التحديد ومع مستوى عال من مراقبة الجودة، كما هو موضح في هذه الورقة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر بيوفاكا موسكاميد برازيل، وفونداساو دي أمبارو، وبيكيسا دو استادو دي ساو باولو، وكونسيلهو ناسيونال دي ديسينفولفيمنتو سينتيفيكو إي تيكولوجيا (CNPq) على الدعم المالي. ونود أيضا أن نشكر الأشخاص التالية مساعدتهم؛ ميريام دوس سانتوس، غيلديان سيلفا، جيسيلين دوس سانتوس، فابيو غونسالفيس، جون بول أوليفيرا، لويزا غارزيرا، خوسيه كارلوس فالنسا.
Materials
|
Vipan Premium |
Sera GmbH |
190 |
http://www.sera.de/uk/pages/products/product/sera-vipan-3.html |
Required for rearing RIDL larvae |
|
Tetracycline |
Sigma Aldrich |
T7660 |
Required for rearing RIDL larvae |
|
|
Plate separator |
J.W. Hock |
5412 |
http://www.johnwhock.com/download/manuals/instr_5412_separator.pdf |
Separating larvae and pupae |
|
Parafilm M |
Pechiney Plastic packing |
PM-996 |
Cover plate for blood feeding system |
|
|
Rearing pans for Release generation (53 cm x 38 cm x 8 cm) |
Pleion |
0757 |
Larval rearing Release generation |
|
|
Fluorescent scope |
Leica Microsystems |
MZ FLIII |
http://www.leica-microsystems.com/fileadmin/downloads/Leica%20MZ%20FLIII/Brochures/M1-160-0de.pdf |
Viewing fluorescent RIDL larvae |
|
Adult cages |
BugDorm |
DP1000 |
http://bugdorm.megaview.com.tw/bugdorm-1-insect-rearing-cage-30x30x30-cm-pack-of-one-p-29.html |
Cages for Egg production colony |
|
Filter paper |
CELAB |
Filter paper for egg laying |
References
- Dyck, V., et al. Sterilizing Insects with Ionizing Radiation. Sterile Insect Technique. , 233-268 (2005).
- Dyck, V., Hendrichs, J., Robinson, A. S., Klassen, W., Curtis, C. History of the Sterile Insect Technique.. Sterile Insect Technique. , 3-36 (2005).
- Alphey, L., et al. Sterile-insect methods for control of mosquito-borne diseases – an analysis. Vector Borne Zoonotic Dis. 10, 295-311 (2010).
- Thomas, D. D., Donnelly, C. A., Wood, R. J., Alphey, L. S. Insect population control using a dominant, repressible, lethal genetic system. Science. 287, 2474-2476 (2000).
- Fu, G., et al. Female-specific insect lethality engineered using alternative splicing. Nat. Biotechnol. 25, 353-357 (2007).
- Fu, G., et al. Female-specific flightless phenotype for mosquito control. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4550-4554 (2010).
- Gong, P., et al. A dominant lethal genetic system for autocidal control of the Mediterranean fruitfly. Nat. Biotechnol. 23, 453-456 (2005).
- Phuc, H. K., et al. Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control. BMC Biol. 5 (11), (2007).
- Harris, A. F., et al. Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes. Nat. Biotechnol. 30, 828-830 (2012).
- Harris, A. F., et al. Field performance of engineered male mosquitoes. Nat. Biotechnol. 29, 1034-1037 (2011).
- Bailey, D. L., Lowe, R. E., Dame, D. A., Seawright, J. A. Mass rearing the genetically altered MACHO strain of Anopheles albimanus Wiedemann. Am. J. Trop. Med. Hyg. 29, 141-149 (1980).
- Benedict, M. Q., et al. Colonisation and mass rearing: learning from others. Malar. J.. 8 Suppl 2 (S4), (2009).
- Alphey, L. Re-engineering the sterile insect technique. Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1243-1247 (2002).
- Wise de Valdez, ., R, M., et al. Genetic elimination of dengue vector mosquitoes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4772-4775 (2011).
- Macoris Mde, ., L, , et al. Resistance of Aedes aegypti from the state of Sao Paulo, Brazil, to organophosphates insecticides.. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 98, 703-708 (2003).
- Campos, J., Andrade, C. F. Larval susceptibility of Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus populations to chemical insecticides. Rev. Saude Publica. 37, 523-527 (2003).
- Gubler, D. J. Resurgent vector-borne diseases as a global health problem. Emerg. Infect. Dis. 4, 442-450 (1998).
- Harris, A. F., Rajatileka, S., Ranson, H. Pyrethroid resistance in Aedes aegypti from Grand Cayman. Am. J. Trop. Med. Hyg. 83, 277-284 (2010).
- Lima, J. B., et al. Resistance of Aedes aegypti to organophosphates in several municipalities in the State of Rio de Janeiro and Espirito Santo. Am. J. Trop. Med. Hyg. 68, 329-333 (2003).
- Paris, M., et al. Persistence of Bacillus thuringiensis israelensis (Bti) in the environment induces resistance to multiple Bti toxins in mosquitoes. Pest Manag. Sci. 67, 122-128 (2010).
- Rendon, P., McInnis, D., Lance, D., Stewart, J. Medfly (Diptera: Tephritidae) genetic sexing: large-scale field comparison of males-only and bisexual sterile fly releases in Guatemala. J. Econ. Entomol. 97, 1547-1553 (2004).
- Papathanos, P. A., et al. Sex separation strategies: past experience and new approaches. Malar. J.. 8 Suppl 2 (S5), (2009).
- Medici, A., et al. Studies on Aedes albopictus larval mass-rearing optimization. J. Econ. Entomol. 104, 266-273 (2011).
- Focks, D. A. An improved separator for the developmental stages, sexes and species of mosquito (Diptera Culicidae).. J. Med. Entomol. 17, 567-568 (1980).
- Fay, R. W., McCray, E. M., Kilpatrick, J. W. Mass production of sterilized male Aedes aegypti. Mosquito News. 23, 210-214 (1963).
- Christophers, S. R. . Aedes aegypti the yellow fever mosquito: Its life history, Bionomics and Structure. , (2009).
- Jones, J. C. A simple method for sexing living Anopheles Larvae (diptera, culicidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 50, 104-106 (1957).
- Koenraadt, C. J. M. Pupal Dimensions as Predictors of Adult Size in Fitness Studies of Aedes aegypti (Diptera Culicidae).. J. Med. Entomol. 45, 331-336 (2008).
- Alphey, L., Nimmo, D., O’Connell, S., Alphey, N. Insect population suppression using engineered insects. Adv. Exp. Med. Biol. 627, 93-103 (2008).
- Alphey, N., Bonsall, M. B., Alphey, L. Modeling resistance to genetic control of insects. J. Theor. Biol. 270, 42-55 (2011).
- Atkinson, M. P., et al. Analyzing the control of mosquito-borne diseases by a dominant lethal genetic system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 9540-9545 (2007).
- Bargielowski, I., Nimmo, D., Alphey, L., Koella, J. C. Comparison of life history characteristics of the genetically modified OX513A line and a wild type strain of Aedes aegypti. PLoS One. 6 (e20699), (2011).
- Bargielowski, I., Alphey, L., Koella, J. C. Cost of mating and insemination capacity of a genetically modified mosquito Aedes aegypti OX513A compared to its wild type counterpart. PLoS One. 6 (26086), (2011).
