Produção em massa de Aedes aegypti geneticamente modificado para lançamentos de campo no Brasil

Requisitos inseticidos 1. Visão geral A criação em massa tem várias fases, cada uma das quais é realizada em uma área distinta da unidade de criação em massa. A Figura 1 mostra a fase principal da criação e onde ocorrem na instalação de criação em massa. 2. Considerações de Biossegurança para o Insectary O projeto foi aprovado pela comissão de ética animal da Universidade de São Paulo – Brasil e todas as autorizações e aprovações necessárias foram obtidas. O sistema RIDL usa letalidade condicional; um suplemento dietético (tetraciclina) impede a expressão do sistema RIDL permitindo que os insetos sejam criados em massa; sem tetraciclina, os mosquitos morrem. A tetraciclina não é encontrada nos criadouros de Ae. aegypti na natureza para que qualquer descendente produzido de fugitivos não sobreviva.  Isso adiciona um nível extra de segurança sobre o uso de insetos do tipo selvagem (WT) esterilizados por outros métodos (ou seja, radiação). Use entrada de porta dupla, placas “Somente pessoal autorizado” e telas de insetos no inseto. Qualquer janela deve ser selada para evitar a contaminação da colônia com insetos WT e ajudar a evitar fugas de dentro do inseto. Regulamentos e autoridades locais podem ter requisitos adicionais ou alternativos específicos. Entre em contato com as autoridades competentes para obter informações/orientações em um estágio inicial e garanta todas as licenças e aprovações necessárias antes de estabelecer a cepa RIDL em um inseto. O inseticário de criação em massa só deve ser usado para a criação ridl. Nenhuma outra cepa ou insetos deve estar presente. Isto é para evitar a contaminação da cepa RIDL e contaminação com patógenos que podem afetar o condicionamento físico e a sobrevivência, reduzindo a produtividade e a eficácia dos machos soltos. 3. Design In insectário A Figura 2 mostra um plano do inseto utilizado na Biofábrica Moscamed no Brasil. A temperatura de todos os quartos foi de 26 °C ± 2) com umidade relativa de 70-80% e 12:12 hr luz: ciclo escuro usando tiras de luz fluorescentes. Este projeto pode ser modificado de acordo com requisitos específicos de espaço, por exemplo, a escala da versão determinará o tamanho geral. No entanto, a produção, criação e classificação de ovos, controle de qualidade (QC) e lançamentos devem ser separados em quatro áreas distintas: Colônia de Produção de Ovos, Geração de Lançamento, QC e Armazenamento Adulto para Lançamento. A sala colônia de produção de ovos (aproximadamente 20 m2) é usada para produzir ovos para a geração de lançamento. A área de Controle de Qualidade é onde são realizados experimentos para verificar procedimentos e a aptidão da linha RIDL, incluindo medidas de taxa de escotilha, números de pupas, tamanho de pupa e eficácia de medição de classificação e remoção de fêmeas. Também são realizados testes para contaminação por WT verificando a presença de marcador de fluorescência e fenótipo usando ensaios offset que medem a letalidade. A sala de Geração de Liberação (aproximadamente 36 m2) requer espaço adequado para bandejas e a triagem de larvas e pupas. As bandejas são mantidas em racks de alumínio construídos com propósito. Uma grande área de trabalho e pia são necessárias para a criação e triagem e outra pia grande é necessária para a lavagem de bandejas e gaiolas. Uma armadilha de captura de filtros foi incluída na saída de água residuais das pias para mitigar a fuga de mosquitos vivos através do esgoto. Toda a água utilizada para as bandejas é descartada através de um ralo, que possui um compartimento contendo uma malha que impede a fuga de insetos em qualquer estágio de desenvolvimento. Uma área é necessária para o armazenamento de adultos para lançamento (Adult Storage for Release, Figura 2) contendo racking para segurar os dispositivos de liberação enquanto os adultos amadurecem antes do lançamento. Métodos de produção para criação em massa RIDL: A Colônia de Produção de Ovos produz os ovos que são utilizados na Geração de Liberação (Figura 1)para produzir adultos. Há muitas semelhanças nos dois métodos de criação, mas também algumas diferenças distintas. Os processos de criação que são os mesmos para ambos os procedimentos são descritos apenas na seção Colônia de Produção de Ovos. Colônia de Produção de Ovos 4. Produção larval A Colônia de Produção de Ovos gera ovos OX513A RIDL homozigos8 para a Geração de Liberação. O controle de alta qualidade garante viabilidade, condicionamento físico e integridade dos ovos fornecidos. O estímulo para a eclosão é a submersão na água com um baixo nível de oxigênio dissolvido. Para reduzir o nível de oxigênio na água, aqueça a água até ferver e coloque imediatamente 400 ml em potes de vidro de 500 ml (circunferência de abertura de 74 mm), aperte a tampa com segurança e deixe à temperatura ambiente por várias horas para esfriar. Coloque 1 g de ovos em um pote de água fervida, sele e espere por uma hora. Transfira o conteúdo para uma bandeja com 2 L de água e deixe durante a noite em condições inseticida. Coloque as larvas eclodidas em um volume conhecido de água e mexa usando um agitador magnético e pulga por tempo suficiente para tomar alíquotas; mexer vigorosamente ou por tempo prolongado danifica larvas e deve ser mantido ao mínimo. O volume padrão usado para chocar larvas é de 1 L, porém densidades de mais de 300 larvas/ml são difíceis de contar e podem ser prejudiciais. Portanto, não eclodam mais de 300.000 ovos/L de água. Determine a taxa de escotilha tomando três alíquotas de 1 ml e colocando em uma folha de papel absorvente, com uma grade de 1 cm quadrados, em cima de uma esponja absorvente para absorver qualquer excesso de água.  Conte o número de ovos eclodidos e nãotched de três quadrados procurando a tampa faltante de um ovo eclodido. Uma taxa de escotilha em torno de 80-90% é esperada. Pegue quatro alíquotas de 1 ml cada e coloque em quatro barcos de pesagem pretos (larvas são brancas e, portanto, mais facilmente visíveis contra um fundo preto) e conte o número de larvas vivas presentes pelos olhos; recomenda-se o uso de um contador. O número médio de larvas por ml é então usado para calcular o volume de água para adicionar em cada bandeja para obter o número desejado de larvas por bandeja. Pode haver grandes diferenças na densidade em que as larvas podem ser criadas entre cepas e espécies. Também é desejável comparar o tamanho masculino adulto RIDL com os machos do tipo selvagem; idealmente você quer semelhante a machos RIDL de tamanho maior que podem competir com sucesso com machos selvagens. Portanto, para cada cepa RIDL, a densidade ideal de larvas precisa ser determinada e é uma troca contra as restrições de espaço para a criação e a escala de produção. Densidades que variam de 0,1-2,5 larva/ml que encontramos como uma boa combinação de produção e qualidade; também discutido por Medici23. Adicione as larvas às bandejas. Em nossa instalação usamos bandejas medindo cerca de 53 cm x 37 cm x 8 cm (L x W x H) e a quantidade necessária de água para alcançar a densidade de larvas para produção. Adicione uma solução de estoque de tetraciclina (3 mg/ml em água) às bandejas a uma diluição de 1:100 para obter a concentração final necessária de 30 μg/ml. Alimente larvas com alimentos de peixe floco(www.sera.de)diariamente, que foi esmagada em pó fino. A Tabela 1 mostra o regime típico de alimentação em mg de alimentos por larvas por dia. Alimentar larvas até o dia apropriado de triagem sob as condições insetíduas descritas acima. 5. Classificação de Larvas de Pupae e Pupae Macho/Fêmea Classifique larvas de pupas 8 dias após a eclosão separando as larvas da pupa. Então, sexo tipo a pupae para machos. Um dispositivo conhecido como separador deplacas 24,25 pode classificar larvas de pupas machos e de pupas fêmeas. A Figura 3 ilustra o uso deste separador de placas para separar larvas do macho e da pupa fêmea. Usando uma colher de medição com uma malha na parte inferior, calibra-a com 500 pupas ou mais e use-a para montar gaiolas e estimar a quantidade total de pupas machos e fêmeas produzidas. No primeiro dia de triagem (dia 8) a maioria das pupas são machos, então coloque as larvas classificadas de volta em uma bandeja e volte até o dia seguinte, quando a maioria das pupas são fêmeas(Figura 4). Repita o processo de triagem a cada dia, conforme descrito nas etapas 2.1-2.3 até que todas as larvas tenham filhote ou até o final de uma semana de trabalho. Coloque 1.000 pupas machos (usando a colher de medida) em uma gaiola e no dia 9 adicione 3.000 pupas fêmeas à mesma gaiola (usamos tubos de PVC de 30 cm de altura e 30 cm de diâmetro adaptados com topo de malha e um orifício de acesso líquido, mas 30 cm x 30 cm x 30 cm de gaiolas plásticas também estão disponíveis no BugDorm). Permitir que os adultos acasalem por pelo menos 2 dias e forneçam-lhes solução de sacarose (10%) em algodão molhado ad libitum antes da alimentação sanguínea. Coletar ovos por duas semanas (~dois ciclos gonotróficos) com duas rações de sangue por semana. Isso rende uma média de 143.000 ovos de uma gaiola de 3.000 fêmeas (uma média de 48 ovos/fêmea). Para a produção de 4 milhões de ovos por semana, cerca de 28 gaiolas precisam ser montadas a cada semana. 6. Alimentação sanguínea Um sistema de alimentação de placas de alumínio fornece gaiolas com sangue duas vezes por semana. Um bolsão de sangue é criado na lateral de uma placa de alumínio (10 cm x 10 cm x 3 mm) com Parafilm(Figura 5). Para incentivar a alimentação, o sangue é aquecido colocando um saco de feijão aquecido em cima do alimentador de pratos. O saco de feijão consistia de aproximadamente 250 g de grãos de trigo em um saco de pano, que é aquecido por cerca de 10 segundos em um micro-ondas. O sangue que usamos para alimentação é de um matadouro local; como esses animais (principalmente cabras e ovinos) são para consumo humano, eles são testados para evitar a presença de patógenos. Três dias após a alimentação sanguínea, um local de oviposição para as fêmeas colocarem seus ovos é fornecido. O local de oviposição é um recipiente de plástico redondo cheio de cerca de 1/4 com água e papel filtro cobrindo o interior. Dois dias depois, o local da oviposição é removido. Para a produção máxima de ovos, certifique-se de que o papel do filtro cubra toda a superfície disponível dentro do recipiente e permaneça molhado. Remova o papel do ovo e coloque no papel absorvente para secar em condições insetívias; ovos requerem um período de condicionamento em alta umidade (mais de 70%) de pelo menos 48 horas após ser colocado. Os ovos podem ser deixados no inseto por até 3 meses com redução mínima na taxa de escotilha, desde que a umidade seja mantida alta25. A colônia de produção de ovos precisa ser de tamanho suficiente para fornecer o número de ovos necessários semanalmente para o programa de liberação. A instalação descrita acima pode produzir aproximadamente 4 milhões de ovos com 28 gaiolas criadas semanalmente. Recomenda-se manter ovos suficientes armazenados para garantir pelo menos 4 semanas de ovos para a Geração de Sol e Colônia de Produção de Ovos. Geração de Lançamento 7. Produção larval Os processos de eclosão, criação e triagem para a geração de lançamento são idênticos ao método descrito anteriormente para a colônia de produção de ovos. No entanto, a escala de produção é muito maior e isso requer mais bandejas e mais esforço. 8. Triagem larvas, pupas machos e pupas fêmeas A classificação de larvas, pupas machos e pupas fêmeas é idêntica ao método descrito para produção de ovos. Após a triagem da pupa macho é importante verificar se há contaminação feminina antes da liberação; não deve haver mais de 1% de mulheres presentes. Pegue três alíquotas de 500 pupas (três colheres de medição aleatórias de pupas) e conte o número de pupas fêmeas presentes. As fêmeas podem ser identificadas, pois são geralmente maiores que os machos e por diferenças na forma do lobo genital(Figura 6)27. Se houver mais de 1% de fêmeas, elas devem ser recorrer e verificar novamente. Use apenas os machos dos dias 8 e 9 para liberação; autoclave qualquer larva restante e pupae. No Brasil, esse resíduo deve ser tratado da mesma forma que o lixo médico, mas as regulamentações podem diferir em outros países. Não utilize pupas e larvas fêmeas da Geração de Liberação para a Colônia de Produção de Ovos devido a diferenças no controle de qualidade, na criação e na contaminação de números maiores e menor controle de qualidade. Armazenamento adulto para lançamento: Coloque os machos em dispositivos de liberação para emergir e amadurecer antes do lançamento. Os detalhes dos dispositivos de liberação não estão cobertos neste método. No entanto, a capacidade dos dispositivos de liberação que usamos é de cerca de 1.000 homens. Os detalhes do método de liberação (dispositivo de liberação e sistema de liberação) não estão cobertos neste método.