ブラジルにおけるフィールドリリースのための遺伝子組み換え Aedes aegypti の大量生産

昆虫の要件 1. 概要 質量の飼育は、それぞれがマスリアリングユニットの異なる領域で行われるいくつかのフェーズを持っています。 図1 は、飼育の主な段階と、それらが大量の飼育施設で発生する場所を示しています。 2. 昆虫のバイオセキュリティに関する考察 このプロジェクトは、サンパウロ大学(ブラジル)の動物倫理委員会によって承認され、必要なすべての許可と承認が得られました。 RIDL システムは条件付き致死性を使用します。栄養補助食品(テトラサイクリン)は、昆虫を大量に飼育することを可能にするRIDL系の発現を防ぐ。テトラサイクリンがなければ蚊は死ぬ。テトラサイクリンは野生のAe.aegyptiの繁殖地には見つからないので、脱出から生み出された子孫は生き残りません。 これは、他の方法(すなわち放射線)によって殺菌された野生型(WT)昆虫を使用する上で、セキュリティの追加レベルを追加します。 二重ドア入力、「公認人員のみ」の標識と昆虫スクリーンを使用して、昆虫の中に。任意の窓は、WT昆虫とのコロニーの汚染を避けるために密封され、昆虫の中からの脱出を防ぐのに役立つ必要があります。 現地の規制および当局には、特定の追加要件または代替要件がある場合があります。早い段階で情報やガイダンスについては関係当局に連絡し、必要な許可と承認を確保してから、昆虫の中でRIDL株を確立してください。 大量飼育昆虫はRIDL飼育にのみ使用してください。他の株や昆虫は存在してはならない。これは、RIDL株の汚染と、フィットネスと生存に影響を与える可能性のある病原体との汚染を避け、解放された男性の生産性と有効性を低下させるためです。 3. 昆虫設計 図2 は、ブラジルのビオハブリカ・モスカメッドで使用された昆虫の計画を示す。 全室の温度は26°C±2)で、相対湿度は約70~80%、蛍光灯を用いた12:12時間の明度:暗いサイクルでした。 このブループリントは、特定のスペース要件に従って変更できます (例えば 、リリースのスケールが全体的なサイズを決定します)。しかし、卵の生産、飼育と選別、品質管理(QC)およびリリースは、4つの異なる領域に分ける必要があります:卵生産コロニー、リリース生成、QC、およびリリースのための成人貯蔵。 卵生産コロニールーム(約20 m2)は、放出生成のための卵を生産するために使用されます。 品質管理領域は、ハッチレート、子犬の数、子犬の大きさ、女性の選別と除去の有効性を測定するなど、手順とRIDLラインの適合性をチェックするための実験を行う場所です。また、致死性を測定するオフセットアッセイを用いて蛍光マーカーと表現型の有無をチェックすることにより、WT汚染の検査も行われます。 剥離生成室(約36 m2)には、トレイと幼虫や子犬の選別のための十分なスペースが必要です。皿は専用のアルミニウム製の棚に保持される。大きな作業領域とシンクは、飼育と仕分けのために必要とされ、別の大きなシンクは、トレイやケージの洗浄に必要です。フィルターキャッチトラップは、下水道を通して生きている蚊の脱出を軽減するために、シンクから排水口に含まれています。 トレイに使用されるすべての水は、開発のどの段階でも昆虫の脱出を防ぐメッシュを含むコンパートメントを持つドレインを通して配置されます。 大人がリリース前に成熟している間、リリースデバイスを保持するためのラックを含むリリース(リリース用の成人ストレージ、 図2)のための大人の保管には、エリアが必要です。 RIDL を大量に飼育するための製造方法: 卵生産コロニーは、成人を生産するために放出生成(図1)で使用される卵を生産します。2 つのリアリング方法には多くの類似点がありますが、いくつかの明確な違いもあります。両方の手順で同じ飼育プロセスについては、エッグ生産コロニーセクションのみで説明します。 卵生産コロニー 4. ラーバル生産 卵生産コロニーは放出生成のためのホモ接合OX513A RIDLの卵8 を発生させる。高い品質管理は、供給された卵の生存率、適合性およびひずみの完全性を保証します。 孵化の刺激は、溶存酸素の低レベルで水中に沈む。水中の酸素濃度を下げるには、沸騰するまで水を加熱し、すぐに500mlのガラス瓶(74mmの開口円周)に400mlを入れ、蓋をしっかりと固定し、室温で数時間放置して冷却します。 沸騰したお湯の瓶に卵1gを入れ、再シールし、1時間待ちます。内容物を2L水でトレイに移し、昆虫条件下で一晩放置します。 孵化した幼虫を既知の水の体積に入れ、磁気スターラーとノミを使用してアリコートを取るのに十分な時間をかき混ぜます。激しくかき混ぜるか、または長い時間のために幼虫を損傷し、最小限に抑えるべきです。幼虫の孵化に使用される標準的な体積は1 Lですが、300以上の幼虫/mlの密度は数えにくく、損傷を与える可能性があります。したがって、約30万個以上の水を孵化しないでください。 3つの1 mlアリコートを取り、1cmの正方形のグリッドを持つ吸収性紙の上に、余分な水を浸すために吸収性スポンジの上に置くことによって、ハッチレートを決定します。 孵卵の欠けているキャップを探して、3つの正方形から孵化卵と孵化していない卵の数を数えます。ハッチ率は80~90%前後と予想されます。 それぞれ1mlの4つのアリコートを取り、4つの黒い重量を量るボート(幼虫は白く、したがって黒い背景に対してより容易に見える)に入れ、目で存在する生きた幼虫の数を数えます。カウンターの使用をお勧めします。ml当たりの平均幼虫数は、各トレイに追加する水の量を計算するために使用され、トレイあたりの必要な幼虫数を得る。 幼虫が系統と種の間で飼育される密度には大きな違いがある。また、RIDL成人男性のサイズを野生型の男性と比較することも望ましいです;理想的には、野生の男性と正常に競合することができる大きなサイズのRIDLの男性に似てしたいです.したがって、各RIDL株の場合、幼虫の理想的な密度を決定する必要があり、飼育のためのスペース制約と生産の規模に対するトレードオフです。0.1~2.5の幼虫/mlの密度は、生産生産と品質の良い組み合わせであることが分かりました。また、メディチ23によって議論. トレイに幼虫を加えます。当社の施設では、約53cm×37cm x 8cm(L x W x H)のトレイと必要な量の水を使用して、生産用の幼虫の密度を達成しています。 テトラサイクリン(水中3mg/ml)のストック溶液を1:100希釈でトレイに加え、必要な最終濃度30μg/mlを得ます。 幼虫にフレークフィッシュフード(www.sera.de)を毎日食べ、細かい粉に押しつぶします。 表1 は、一日あたりの幼虫あたりの食物のmgにおける典型的な摂食体制を示す。上述の昆虫条件下での選別の適切な日まで幼虫を供給する。 5. 子犬と男性/女性の子犬から幼虫を選別 幼虫と子犬を分離して孵化の8日後に子犬から幼虫を選別する。その後、男性のための子犬をセックスソート。プレート分離器24,25 として知られている装置は、雄の子犬と雌の子犬から幼虫を選別することができます。 図3 は、幼虫と雌の子犬を分離するためにこのプレートセパレータを使用することを示す。 底にメッシュを入れた測定スプーンを使用して、500匹以上の子犬でキャリブレーションし、ケージを設置し、生産された男性とメスの子犬の総量を推定するために使用します。 選別の初日(8日目)は、ほとんどの子犬は男性なので、並べ替えられた幼虫をトレイに戻し、子犬のほとんどが女性である翌日まで後方に戻します(図4)。 すべての幼虫が子犬になるまで、または作業週の終わりまで、ステップ2.1-2.3に記載されているように、毎日ソートプロセスを繰り返します。 ケージに1,000匹のオスの子犬(メジャースプーンを使用)を入れ、9日目に同じケージに3,000匹のメスの子犬を加えます(メッシュトップとネットアクセスホールに適合した高さ30cm、直径30cmのPVCパイプを使用していますが、30cm x 30cm x 30cmのプラスチックケージもBugDormから入手可能です)。 大人が少なくとも2日間交尾し、スクロース溶液(10%)を提供することを許可する血液供給の前に湿った綿 のアドリビタム に。週に2回の血液供給で2週間(2回のゴトロフィックサイクル)卵を集める。これは、3,000匹のメス(平均48個の卵/メス)のケージから平均143,000個の卵を生成します。週に400万個の卵を生産するには、毎週約28個のケージを設置する必要があります。 6. 血液供給 アルミニウム板の供給システムは週に2回の血液を入れてケージを供給する。パラフィルム(図5)を使用して、アルミニウム板(10cm x 10cm x 3 mm)の側面に血液のポケットが作成されます。給餌を促すために、加熱されたビーンバッグをプレートフィーダーの上に置くことによって血液を温める。このビーンズバッグは、約250gの小麦粒を布袋に入れ、電子レンジで約10秒間加熱した。私たちが摂食に使用する血液は、地元のアバトワールからです。これらの動物(主にヤギと羊)は、病原体の存在を避けるためにテストされている人間の消費のためである。 授乳の3日後に、メスが卵を産むのに卵子を産むのに対する卵子部位が設けられる。オビポジション部位は、内部を覆う水とろ紙で約1/4に充填された丸いプラスチック容器です。2日後に、卵位部位が除去される。最大の卵の生産のために、フィルターペーパーが容器の中の利用可能な表面全体を覆い、濡れたままであることを確認してください。 卵紙を取り出し、昆虫条件下で乾燥させるために吸収性の紙の上に置きます。卵は、高湿度でのコンディショニングの期間を必要とします (70% 以上)敷設された後、少なくとも48時間の。卵は、湿度が高く保たれている限り、孵化率の最小限の減少で最大3ヶ月間昆虫に残すことができます。 卵生産コロニーは、放出プログラムのために毎週必要な卵の数を提供するのに十分な大きさである必要があります。上記の施設では、毎週28個のケージを設置して約400万個の卵を生産できます。放出生成と卵生産コロニーのための卵の少なくとも4週間を保証するために十分な卵を保管することをお勧めします。 リリース生成 7. ラーバル生産 放出生成のための孵化、飼育および選別プロセスは、卵生産コロニーのための前述の方法と同一である。しかし、生産の規模ははるかに大きく、これはより多くのトレイとより多くの労力を必要とします。 8. 幼虫、男性の子犬、女性の子犬を選別する 幼虫、雄の子犬、雌の子犬の選別は、卵の生産のために記述された方法と同じです。 オスの子犬を選別した後、リリース前に女性の汚染を確認することが重要です。女性が1%を超える存在であってはならない。500匹の子犬(3匹のランダムな子犬測定スプーン)の3つのアリコートを取り、存在する女性の子犬の数を数えます。女性は、一般的に男性よりも大きく、生殖器葉の形状の違いから識別することができる(図6)27。1%以上の女性がいる場合は、リゾートし、再びチェックする必要があります。 リリースのために8日目と9日目から男性のみを使用してください。残りの幼虫と子犬をオートクレーブ。ブラジルでは、この廃棄物は医療廃棄物と同じ方法で処理する必要がありますが、規制は他の国で異なる場合があります。品質管理、大量の飼育および汚染リスクの違い、および品質管理の低下のため、卵生産コロニーの放出生成から雌の子犬や幼虫を使用しないでください。 リリースのための大人のストレージ:リリース前に出現し、成熟するために解放デバイスに男性を配置します。リリース デバイスの詳細については、この方法では説明しません。しかし、私たちが使用するリリースデバイスの容量は約1,000人の男性です。リリース方法の詳細 (リリース デバイスとリリース システム) については、この方法では説明しません。