Massaproductie van genetisch gemodificeerde Aedes aegypti voor veldreleases in Brazilië

Insectenvereisten 1. Overzicht Massaopfok kent verschillende fasen, die elk worden uitgevoerd in een afzonderlijk gebied van de massaopfokeenheid. Figuur 1 toont de hoofdfase van de opfok en waar deze zich voordoen in de massaopfokfaciliteit. 2. Bioveiligheidsoverwegingen voor de insectaire Het project werd goedgekeurd door de commissie dierenethiek van de Universiteit van São Paulo – Brazilië en alle benodigde vergunningen en goedkeuringen werden verkregen. Het RIDL-systeem maakt gebruik van voorwaardelijke letaliteit; een voedingssupplement (tetracycline) voorkomt de expressie van het RIDL-systeem waardoor de insecten massaal kunnen worden grootgebracht; zonder tetracycline sterven de muggen. Tetracycline wordt niet gevonden in de broedplaatsen van Ae. aegypti in het wild, dus eventuele nakomelingen geproduceerd uit ontsnapten zullen het niet overleven.  Dit voegt een extra beveiligingsniveau toe ten opzichte van het gebruik van wilde (WT) insecten die op andere manieren zijn gesteriliseerd(d.w.z. straling). Gebruik dubbele deurinvoer, “Alleen geautoriseerd personeel” -borden en insectenschermen in de insectenstal. Alle ramen moeten worden verzegeld om besmetting van de kolonie met WT-insecten te voorkomen en ontsnappingen vanuit de insecten te voorkomen. Lokale regelgeving en autoriteiten kunnen specifieke aanvullende of alternatieve vereisten hebben. Neem in een vroeg stadium contact op met de relevante autoriteiten voor informatie/begeleiding en beveilig alle benodigde vergunningen en goedkeuringen voordat u de RIDL-stam in een insectenstal vaststelt. De massaopfok-insecten mogen alleen worden gebruikt voor ridl-opfok. Er mogen geen andere stammen of insecten aanwezig zijn. Dit is om besmetting van de RIDL-stam en besmetting met pathogenen te voorkomen die de fitheid en overleving kunnen beïnvloeden, waardoor de productiviteit en effectiviteit van vrijgelaten mannen wordt verminderd. 3. Insectair ontwerp Figuur 2 toont een plan van de insecten die gebruikt worden bij Biofábrica Moscamed in Brazilië. Temperatuur van alle kamers was 26 °C ± 2) met een relatieve vochtigheid van ongeveer 70-80% en een 12:12 uur licht: donker cyclus met behulp van fluorescerende lichtstrips. Deze blauwdruk kan worden aangepast aan specifieke ruimtevereisten, bijvoorbeeld de schaal van de release bepaalt de totale grootte. De eierproductie, opfok en sortering, kwaliteitscontrole (QC) en releases moeten echter worden gescheiden in vier verschillende gebieden: Egg Production Colony, Release Generation, QC en Adult Storage for Release. De egg production colony room (ongeveer 20m2)wordt gebruikt om eieren te produceren voor de releasegeneratie. In het gebied kwaliteitscontrole worden experimenten uitgevoerd om de procedures en de geschiktheid van de RIDL-lijn te controleren, waaronder metingen van de broedsnelheid, poppenaantallen, poppengrootte en het meten van de effectiviteit van het sorteren en verwijderen van vrouwtjes. Er worden ook tests uitgevoerd op WT-verontreiniging door te controleren op de aanwezigheid van fluorescentiemarker en fenotype met behulp van offsettests die de letaliteit meten. De Release Generation ruimte (ongeveer 36 m2) vereist voldoende ruimte voor trays en het sorteren van larven en poppen. De trays worden bewaard in speciaal gebouwde aluminium rekken. Een groot werkgebied en gootsteen zijn nodig voor het opfokken en sorteren en een andere grote gootsteen is vereist voor het wassen van trays en kooien. In de afvalwaterafvoer van de gootstenen is een filtervangvanger opgenomen om de ontsnapping van levende muggen door het riool te beperken. Al het water dat voor de trays wordt gebruikt, wordt afgevoerd via een afvoer, die een compartiment heeft met een gaas dat de ontsnapping van insecten in elk stadium van ontwikkeling voorkomt. Er is een ruimte vereist voor de opslag van volwassenen voor vrijgave (Adult Storage for Release, figuur 2) met rekken om de ontgrendelingsapparaten vast te houden terwijl de volwassenen volwassen zijn voordat ze worden losgelaten. Productiemethoden voor massaopfok RIDL: De eierproductiekolonie produceert de eieren die worden gebruikt in de releasegeneratie (figuur 1) om volwassenen te produceren. Er zijn veel overeenkomsten in de twee opfokmethoden, maar ook enkele duidelijke verschillen. De opfokprocessen die voor beide procedures hetzelfde zijn, worden alleen beschreven in de sectie Eiproductiekolonie. De Kolonie van de Productie van het ei 4. Larvale productie De Egg Production Colony genereert homozygote OX513A RIDL eieren8 voor de Release Generation. Een hoge kwaliteitscontrole garandeert de levensvatbaarheid, geschiktheid en stamintegriteit van de geleverde eieren. De stimulans voor het uitkomen is onderdompeling in water met een laag niveau van opgeloste zuurstof. Om het zuurstofgehalte in het water te verlagen, verwarmt u het water totdat het kookt en plaatst u onmiddellijk 400 ml in glazen potten van 500 ml (74 mm openingsomtrek), bevestigt u het deksel stevig en laat u het enkele uren op kamertemperatuur afkoelen. Doe 1 g eieren in een pot gekookt water, reseal en wacht een uur. Breng de inhoud over in een bak met 2 L water en laat ‘s nachts onder insectenomstandigheden staan. Plaats de uitgebroede larven in een bekend volume water en roer met behulp van een magneetroerder en vlo gedurende voldoende tijd om aliquots te nemen; krachtig roeren of voor langere tijd beschadigt larven en moet tot een minimum worden beperkt. Het standaardvolume dat wordt gebruikt om larven uit te broeden is 1 L, maar dichtheden van meer dan 300 larven / ml zijn moeilijk te tellen en kunnen schadelijk zijn. Kom daarom niet meer dan ongeveer 300.000 eieren/L water uit. Bepaal de uitkomstsnelheid door drie aliquots van 1 ml te nemen en op een vel absorberend papier, met een rooster van 1 cm vierkanten, bovenop een absorberende spons te plaatsen om overtollig water op te nemen.  Tel het aantal uitgebroede en niet-uitgebroede eieren van drie vierkanten door te zoeken naar de ontbrekende dop van een uitgebroed ei. Een hatch rate rond de 80-90% wordt verwacht. Neem vier aliquots van elk 1 ml en plaats in vier zwarte weegboten (larven zijn wit en daarom beter zichtbaar tegen een zwarte achtergrond) en tel het aantal levende larven dat met het oog aanwezig is; het gebruik van een teller wordt aanbevolen. Het gemiddelde aantal larven per ml wordt vervolgens gebruikt om het volume water te berekenen dat aan elke tray moet worden toegevoegd om het gewenste aantal larven per tray te krijgen. Er kunnen grote verschillen zijn in de dichtheid waarmee larven kunnen worden grootgebracht tussen stammen en soorten. Het is ook wenselijk om ridl volwassen mannelijke grootte te vergelijken met wilde type mannetjes; idealiter wilt u vergelijkbaar zijn met grotere RIDL-mannetjes die met succes kunnen concurreren met wilde mannetjes. Daarom moet voor elke RIDL-stam de ideale dichtheid van larven worden bepaald en is het een afweging tegen ruimtebeperkingen voor de opfok en de schaal van de productie. Dichtheden variërend van 0,1-2,5 larve/ml hebben we gevonden als een goede combinatie van productie-output en kwaliteit; ook besproken door Medici23. Voeg de larven toe aan trays. In onze faciliteit gebruiken we trays van ongeveer 53 cm x 37 cm x 8 cm (L x B x H) en de vereiste hoeveelheid water om de dichtheid van larven voor productie te bereiken. Voeg een stamoplossing tetracycline (3 mg/ml water) toe aan de trays in een verdunning van 1:100 om de vereiste eindconcentratie van 30 μg/ml te verkrijgen. Voer larven dagelijks met vlokvisvoer(www.sera.de),dat tot een fijn poeder is vermalen. Tabel 1 toont het typische voedingsregime in mg voedsel per larve per dag. Voer larven tot de juiste sorteerdag onder de hierboven beschreven insectenomstandigheden. 5. Larven sorteren van poppen en mannelijke/vrouwelijke poppen Sorteer larven van poppen 8 dagen na het uitkomen door de larven van de poppen te scheiden. Dan sex-sort de poppen voor mannen. Een apparaat dat bekend staat als een plaatscheider24,25 kan larven sorteren van mannelijke poppen en van vrouwelijke poppen. Figuur 3 illustreert het gebruik van deze plaatscheider om larven van mannelijke en vrouwelijke poppen te scheiden. Gebruik een maatlepel met een gaas aan de onderkant, kalibreer deze met 500 poppen of meer en gebruik deze om kooien op te zetten en de totale hoeveelheid geproduceerde mannetjes en vrouwtjespoppen te schatten. Op de eerste dag van sortering (dag 8) zijn de meeste poppen mannetjes, dus plaats de gesorteerde larven terug in een bakje en ga naar achteren tot de volgende dag wanneer de meeste poppen vrouwtjes zijn (figuur 4). Herhaal het sorteerproces elke dag zoals beschreven in stap 2.1-2.3 totdat alle larven zijn verpopt of tot het einde van een werkweek. Plaats 1.000 mannelijke poppen (met behulp van de maatlepel) in een kooi en voeg op dag 9 3.000 vrouwelijke poppen toe aan dezelfde kooi (we gebruiken PVC-buizen met een diameter van 30 cm en een diameter van 30 cm aangepast met gaasblad en een nettoegangsgat, maar 30 cm x 30 cm x 30 cm plastic kooien zijn ook verkrijgbaar bij BugDorm). Laat volwassenen minstens 2 dagen paren en voorzie hen van sacharoseoplossing (10%) op nat katoen ad libitum voor bloedvoeding. Verzamel eieren gedurende twee weken (~ twee gonotrofe cycli) met twee bloedvoeders per week. Dit levert gemiddeld 143.000 eieren op uit een kooi van 3.000 vrouwtjes (gemiddeld 48 eieren/vrouwtjes). Voor de productie van 4 miljoen eieren per week moeten er elke week ongeveer 28 kooien worden opgezet. 6. Bloedvoeding Een aluminium plaatvoersysteem voorziet kooien twee keer per week van bloed. Een zak bloed wordt gemaakt aan de zijkant van een aluminium plaat (10 cm x 10 cm x 3 mm) met Parafilm (Figuur 5). Om het voeren aan te moedigen, wordt het bloed opgewarmd door een verwarmde zitzak bovenop de plaatvoeder te plaatsen. De zitzak bestond uit ongeveer 250 g tarwekorrels in een stoffen zak, die ongeveer 10 seconden in een magnetron wordt verwarmd. Het bloed dat we gebruiken voor het voeren is afkomstig van een lokaal slachthuis; aangezien deze dieren (voornamelijk geiten en schapen) voor menselijke consumptie zijn, worden ze getest om de aanwezigheid van ziekteverwekkers te voorkomen. Drie dagen na bloedtoevoer wordt een ovipositieplaats voor de vrouwtjes om hun eieren te leggen verstrekt. De ovipositieplaats is een ronde plastic container gevuld tot ongeveer 1/4 met water en filterpapier dat de binnenkant bedekt. Twee dagen later wordt de ovipositieplaats verwijderd. Voor een maximale eierproductie moet u ervoor zorgen dat het filterpapier het volledige beschikbare oppervlak in de container bedekt en nat blijft. Verwijder het eierpapier en plaats het op absorberend papier om te drogen onder insectenomstandigheden; eieren vereisen een periode van conditionering bij hoge luchtvochtigheid (meer dan 70%) van ten minste 48 uur na het leggen. Eieren kunnen tot 3 maanden in de insectenstal worden achtergelaten met een minimale afname van de broedsnelheid, zolang de luchtvochtigheid hoog wordt gehouden25. De eierproductiekolonie moet voldoende groot zijn om wekelijks het aantal eieren te leveren dat nodig is voor het releaseprogramma. De hierboven beschreven faciliteit kan ongeveer 4 miljoen eieren produceren met 28 kooien die wekelijks worden opgezet. Het wordt aanbevolen om voldoende eieren opgeslagen te houden om ten minste 4 weken eieren te garanderen voor Release Generation en Egg Production Colony. Release generatie 7. Larvale productie De broed-, opfok- en sorteerprocessen voor de afgiftegeneratie zijn identiek aan de eerder beschreven methode voor de eierproductiekolonie. De schaal van de productie is echter veel groter en dit vereist meer trays en meer inspanning. 8. Larven sorteren, mannelijke poppen en vrouwelijke poppen Het sorteren van larven, mannelijke poppen en vrouwelijke poppen is identiek aan de methode die wordt beschreven voor eiproductie. Na het sorteren van de mannelijke poppen is het belangrijk om te controleren op vrouwelijke besmetting voordat ze worden vrijgelaten; er mag niet meer dan 1% vrouwen aanwezig zijn. Neem drie aliquots van 500 poppen (drie willekeurige poppen maatlepels) en tel het aantal aanwezige vrouwelijke poppen. Vrouwtjes kunnen worden geïdentificeerd omdat zij over het algemeen groter zijn dan mannen en aan verschillen in de vorm van de geslachtskwab (figuur 6)27. Als er meer dan 1% vrouwen zijn, moeten ze hun toevlucht nemen en opnieuw worden gecontroleerd. Gebruik alleen de mannetjes vanaf dag 8 en 9 voor vrijlating; autoclaaf alle resterende larven en poppen. In Brazilië moet dit afval op dezelfde manier worden behandeld als medisch afval, maar de regelgeving kan in andere landen verschillen. Gebruik geen vrouwelijke poppen en larven van de Release Generation voor de Eiproductiekolonie vanwege verschillen in kwaliteitscontrole, opfok- en besmettingsrisico’s van grotere aantallen en lagere kwaliteitscontrole. Opslag voor volwassenen voor release: Plaats mannetjes in ontgrendelingsapparaten om te verschijnen en volwassen te worden voordat ze worden vrijgegeven. De details van de ontgrendelingsapparaten worden niet behandeld in deze methode. De capaciteit van de release-apparaten die we gebruiken is echter ongeveer 1.000 mannen. De details van de releasemethode (releaseapparaat en releasesysteem) worden niet in deze methode behandeld.