Production en masse d’Aedes aegypti génétiquement modifié pour les disséminations sur le terrain au Brésil

Exigences insecticides 1. Vue d’ensemble L’élevage en masse comporte plusieurs phases, dont chacune est effectuée dans une zone distincte de l’unité d’élevage en masse. La figure 1 montre la phase principale de l’élevage et l’endroit où ils se produisent dans l’installation d’élevage de masse. 2. Considérations relatives à la biosécurité pour l’insectaire Le projet a été approuvé par le comité d’éthique animale de l’Université de São Paulo – Brésil et tous les permis et approbations nécessaires ont été obtenus. Le système RIDL utilise la létalité conditionnelle; un complément alimentaire (tétracycline) empêche l’expression du système RIDL permettant aux insectes d’être élevés en masse; sans tétracycline, les moustiques meurent. La tétracycline ne se trouve pas dans les sites de reproduction d’Ae. aegypti à l’état sauvage, de sorte que toute progéniture produite par des évadés ne survivra pas.  Cela ajoute un niveau de sécurité supplémentaire par rapport à l’utilisation d’insectes de type sauvage (WT) stérilisés par d’autres méthodes(c.-à-d. rayonnement). Utilisez l’entrée à double porte, les panneaux « Personnel autorisé seulement » et les moustiquaires dans l’insectaire. Toutes les fenêtres doivent être scellées pour éviter la contamination de la colonie par des insectes WT et aider à prévenir les évasions de l’intérieur de l’insectaire. Les réglementations et autorités locales peuvent avoir des exigences supplémentaires ou alternatives spécifiques. Contacter les autorités compétentes pour obtenir des informations / conseils à un stade précoce, et obtenir tous les permis et approbations nécessaires avant d’établir la souche RIDL dans un insectaire. L’insectaire d’élevage de masse ne doit être utilisé que pour l’élevage ridl. Aucune autre souche ou insecte ne devrait être présent. Il s’agit d’éviter la contamination de la souche RIDL et la contamination par des agents pathogènes qui peuvent affecter la condition physique et la survie, réduisant ainsi la productivité et l’efficacité des mâles relâchés. 3. Conception insectaire La figure 2 montre un plan de l’insectaire utilisé à Biofábrica Moscamed au Brésil. La température de toutes les pièces était de 26 °C ± 2) avec une humidité relative d’environ 70 à 80 % et un cycle lumière-obscurité de 12 h 12 à l’aide de bandes lumineuses fluorescentes. Ce plan peut être modifié en fonction des besoins d’espace spécifiques, par exemple l’échelle de la version déterminera la taille globale. Cependant, la production, l’élevage et le tri des œufs, le contrôle de la qualité (CQ) et les rejets devraient être séparés en quatre zones distinctes : colonie de production d’œufs, génération de rejets, QC et entreposage des adultes en vue de leur remise à l’eau. La salle de la colonie de production d’œufs (environ 20 m2)est utilisée pour produire des œufs pour la génération de libération. La zone de contrôle de la qualité est l’endroit où des expériences sont menées pour vérifier les procédures et l’aptitude de la lignée RIDL, y compris les mesures du taux d’éclosion, du nombre de pupes, de la taille des chrysalides et de la mesure de l’efficacité du tri et de l’élimination des femelles. Des tests sont également effectués pour la contamination wt en vérifiant la présence de marqueur de fluorescence et de phénotype à l’aide d’essais de décalage mesurant la létalité. La salle de génération de libération (environ 36 m2)nécessite un espace suffisant pour les plateaux et le tri des larves et des pupes. Les plateaux sont maintenus dans des racks en aluminium spécialement conçus. Une grande aire de travail et un évier sont nécessaires pour l’élevage et le tri et un autre grand évier est nécessaire pour le lavage des plateaux et des cages. Un piège à filtre a été inclus dans la sortie des eaux usées des éviers pour atténuer la fuite des moustiques vivants par les égouts. Toute l’eau utilisée pour les plateaux est éliminée dans un drain, qui a un compartiment contenant un maillage qui empêche la fuite des insectes à n’importe quel stade de développement. Une zone est requise pour l’entreposage des adultes en vue de leur libération (entreposage pour adultes en vue de leur mise en liberté, figure 2)contenant des rayonnages pour maintenir les dispositifs de libération pendant que les adultes mûrissent avant la mise en liberté. Méthodes de production pour l’élevage en masse RIDL: La colonie de production d’œufs produit les œufs qui sont utilisés dans la génération de libération (figure 1) pour produire des adultes. Il existe de nombreuses similitudes entre les deux méthodes d’élevage, mais aussi des différences distinctes. Les processus d’élevage qui sont les mêmes pour les deux procédures sont décrits dans la section Colonie de production d’œufs seulement. Colonie de production d’œufs 4. Production larvaire La colonie de production d’œufs génère des œufs homozygotes OX513A RIDL8 pour la génération de libération. Un contrôle de haute qualité assure la viabilité, la forme physique et l’intégrité des souches des œufs fournis. Le stimulus pour l’éclosion est la submersion dans l’eau avec un faible niveau d’oxygène dissous. Pour réduire le niveau d’oxygène dans l’eau, chauffez l’eau jusqu’à ébullition et placez immédiatement 400 ml dans des bocaux en verre de 500 ml (circonférence d’ouverture de 74 mm), fixez le couvercle solidement et laissez à température ambiante pendant plusieurs heures pour refroidir. Mettez 1 g d’œufs dans un pot d’eau bouillie, refermez et attendez une heure. Transférer le contenu sur un plateau avec 2 L d’eau et laisser passer la nuit dans des conditions insecticides. Placer les larves écloses dans un volume d’eau connu et remuer à l’aide d’un agitateur magnétique et d’une puce pendant suffisamment de temps pour prendre les aliquotes; l’agitation vigoureuse ou prolongée endommage les larves et doit être réduite au minimum. Le volume standard utilisé pour faire éclore les larves est de 1 L, mais des densités de plus de 300 larves/ml sont difficiles à compter et peuvent être dommageables. Par conséquent, n’éclosez pas plus d’environ 300 000 œufs/L d’eau. Déterminez le taux d’éclosion en prenant trois aliquotes de 1 ml et en plaçant sur une feuille de papier absorbant, avec une grille de carrés de 1 cm, sur une éponge absorbante pour absorber tout excès d’eau.  Comptez le nombre d’œufs éclos et non éclos de trois carrés en recherchant le chapeau manquant d’un œuf éclos. Un taux d’éclosion autour de 80-90% est attendu. Prendre quatre aliquotes de 1 ml chacune et les placer dans quatre bateaux de pesée noirs (les larves sont blanches et donc plus facilement visibles sur fond noir) et compter le nombre de larves vivantes présentes à l’œil nu; l’utilisation d’un compteur est recommandée. Le nombre moyen de larves par ml est ensuite utilisé pour calculer le volume d’eau à ajouter sur chaque plateau pour obtenir le nombre souhaité de larves par plateau. Il peut y avoir de grandes différences dans la densité à laquelle les larves peuvent être élevées entre les souches et les espèces. Il est également souhaitable de comparer la taille des mâles adultes ridl aux mâles de type sauvage; idéalement, vous voulez similaire aux mâles RIDL de plus grande taille qui peuvent rivaliser avec succès avec les mâles sauvages. Par conséquent, pour chaque souche RIDL, la densité idéale des larves doit être déterminée et constitue un compromis avec les contraintes d’espace pour l’élevage et l’échelle de production. Des densités allant de 0,1 à 2,5 larves/ml nous avons trouvées être une bonne combinaison de production et de qualité; également discuté par Médicis23. Ajouter les larves aux plateaux. Dans notre installation, nous utilisons des plateaux mesurant environ 53 cm x 37 cm x 8 cm (L x L x H) et la quantité d’eau requise pour atteindre la densité des larves pour la production. Ajouter une solution mère de tétracycline (3 mg/ml dans l’eau) aux plateaux à une dilution de 1:100 pour obtenir la concentration finale requise de 30 μg/ml. Nourrissez les larves avec de la nourriture de poisson en flocons( www.sera.de) tous les jours, qui a été broyée en une poudre fine. Le tableau 1 montre le régime alimentaire typique en mg de nourriture par larve et par jour. Nourrir les larves jusqu’au jour approprié de tri dans les conditions insecticides décrites ci-dessus. 5. Tri des larves des pupes et des pupes mâles/femelles Trier les larves des pupes 8 jours après l’éclosion en séparant les larves des pupes. Ensuite, triez les pupes pour les mâles. Un dispositif connu sous le nom de séparateur de plaques24,25 peut trier les larves des pupes mâles et des pupes femelles. La figure 3 illustre l’utilisation de ce séparateur de plaques pour séparer les larves des pupes mâles et femelles. À l’aide d’une cuillère à mesurer avec un maillage sur le fond, étalonnez-la avec 500 pupes ou plus et utilisez-la pour installer des cages et estimer la quantité totale de pupes mâles et femelles produites. Le premier jour du tri (jour 8), la plupart des pupes sont des mâles, alors replacez les larves triées dans un plateau et remontez jusqu’au lendemain, lorsque la plupart des pupes sont des femelles(figure 4). Répétez le processus de tri chaque jour tel que décrit aux étapes 2.1 à 2.3 jusqu’à ce que toutes les larves se nymphosent ou jusqu’à la fin d’une semaine de travail. Placez 1 000 pupes mâles (à l’aide de la cuillère à mesurer) dans une cage et le jour 9, ajoutez 3 000 pupes femelles à la même cage (nous utilisons des tuyaux en PVC de 30 cm de haut et de 30 cm de diamètre adaptés avec un dessus en maille et un trou d’accès en filet, mais des cages en plastique de 30 cm x 30 cm x 30 cm sont également disponibles chez BugDorm). Laisser les adultes s’accoupler pendant au moins 2 jours et leur fournir une solution de saccharose (10%) sur le coton humide ad libitum avant l’alimentation par le sang. Recueillir des œufs pendant deux semaines (~ deux cycles gonotrophes) avec deux aliments sanguins par semaine. Cela donne en moyenne 143 000 œufs provenant d’une cage de 3 000 femelles (soit une moyenne de 48 œufs par femelle). Pour la production de 4 millions d’œufs par semaine, environ 28 cages doivent être installées chaque semaine. 6. Alimentation par le sang Un système d’alimentation en plaques d’aluminium fournit du sang aux cages deux fois par semaine. Une poche de sang est créée sur le côté d’une plaque d’aluminium (10 cm x 10 cm x 3 mm) avec parafilm(Figure 5). Pour encourager l’alimentation, le sang est réchauffé en plaçant un sac de haricots chauffé sur le dessus de la mangeoire à assiettes. Le sac de haricots se composait d’environ 250 g de grains de blé dans un sac en tissu, qui est chauffé pendant environ 10 secondes dans un micro-ondes. Le sang que nous utilisons pour l’alimentation provient d’un abattoir local; comme ces animaux (principalement les chèvres et les moutons) sont destinés à la consommation humaine, ils sont testés pour éviter la présence d’agents pathogènes. Trois jours après l’alimentation par le sang, un site de ponte permettant aux femelles de pondre leurs œufs est fourni. Le site de ponte est un récipient en plastique rond rempli à environ 1/4 d’eau et de papier filtre recouvrant l’intérieur. Deux jours plus tard, le site de ponte est retiré. Pour une production maximale d’œufs, assurez-vous que le papier filtre couvre toute la surface disponible à l’intérieur du récipient et reste humide. Retirer le papier d’œuf et le placer sur du papier absorbant pour sécher dans des conditions insecticides; les œufs nécessitent une période de conditionnement à une humidité élevée (plus de 70%) d’au moins 48 heures après avoir été posé. Les œufs peuvent être laissés dans l’insectaire jusqu’à 3 mois avec une diminution minimale du taux d’éclosion, tant que l’humidité est maintenue élevéeà 25. La colonie de production d’œufs doit être d’une taille suffisante pour fournir le nombre d’œufs requis sur une base hebdomadaire pour le programme de mise en liberté. L’installation décrite ci-dessus peut produire environ 4 millions d’œufs avec 28 cages installées chaque semaine. Il est recommandé de conserver suffisamment d’œufs stockés pour garantir au moins 4 semaines d’œufs pour la génération de libération et la colonie de production d’œufs. Génération de versions 7. Production larvaire Les processus d’éclosion, d’élevage et de tri pour la génération de libération sont identiques à la méthode décrite précédemment pour la colonie de production d’œufs. Cependant, l’échelle de production est beaucoup plus grande et cela nécessite plus de plateaux et plus d’efforts. 8. Tri des larves, des pupes mâles et des pupes femelles Le tri des larves, des pupes mâles et des pupes femelles est identique à la méthode décrite pour la production d’œufs. Après avoir trié les pupes mâles, il est important de vérifier la contamination des femelles avant la libération; il ne devrait pas y avoir plus de 1% de femmes présentes. Prenez trois aliquotes de 500 pupes (trois pupes aléatoires mesurant des cuillères) et comptez le nombre de pupes femelles présentes. Les femelles peuvent être identifiées car elles sont généralement plus grandes que les mâles et à partir de différences dans la forme du lobe génital (Figure 6)27. S’il y a plus de 1% de femmes, elles doivent être recouruées et vérifiées à nouveau. N’utilisez que les mâles des jours 8 et 9 pour la libération; autoclaver toutes les larves et pupes restantes. Au Brésil, ces déchets doivent être traités de la même manière que les déchets médicaux, mais les réglementations peuvent différer d’un pays à l’autre. N’utilisez pas de pupes et de larves femelles de la génération de mise à l’eau pour la colonie de production d’œufs en raison des différences dans le contrôle de la qualité, les risques d’élevage et de contamination provenant d’un plus grand nombre et d’un contrôle de qualité inférieur. Entreposage des adultes en cas de libération : Placer les mâles dans des dispositifs de libération pour qu’ils émergent et mûrissent avant la libération. Les détails des dispositifs de libération ne sont pas couverts dans cette méthode. Cependant, la capacité des dispositifs de libération que nous utilisons est d’environ 1 000 hommes. Les détails de la méthode de libération (dispositif de libération et système de libération) ne sont pas couverts dans cette méthode.