ייצור המוני של Aedes aegypti מהונדסים גנטית עבור מהדורות שדה בברזיל

דרישות חרקים 1. סקירה כללית לגידול המוני יש מספר שלבים, שכל אחד מהם מבוצע באזור נפרד של יחידת גידול המסה. איור 1 מציג את השלב העיקרי של גידול והיכן הם מתרחשים במתקן גידול ההמונים. 2. שיקולי אבטחה ביולוגית לחרק הפרויקט אושר על ידי הוועדה לאתיקה של בעלי חיים מאוניברסיטת סאו פאולו – ברזיל וכל האישורים הדרושים הושגו. מערכת RIDL משתמשת בקטלניות מותנית; תוסף תזונה (טטרציקלין) מונע את הביטוי של מערכת RIDL המאפשרת לגדל את החרקים במסה; ללא טטרציקלין היתושים מתים. טטרציקלין לא נמצא באתרי הרבייה של Ae. aegypti בטבע כך שכל צאצא המופק מהבורחים לא ישרוד.  זה מוסיף רמה נוספת של ביטחון על שימוש חרקים מסוג בר (WT) מעוקרים בשיטות אחרות(כלומר קרינה). השתמש בכניסה לדלת כפולה, שלטי “כוח אדם מורשה בלבד” ומסכי חרקים בחרק. כל החלונות צריכים להיות אטומים כדי למנוע זיהום של המושבה עם חרקים WT ולעזור למנוע בריחה מתוך החרקים. לתקנות ולרשויות המקומיות עשויות להיות דרישות ספציפיות נוספות או חלופיות. צרו קשר עם הרשויות הרלוונטיות לקבלת מידע/הדרכה בשלב מוקדם, ואבטחו את כל האישורים והאישורים הדרושים לפני הקמת זן RIDL בחרק. יש להשתמש בגידול המוני של חרקים רק לגידול RIDL. זנים או חרקים אחרים לא צריכים להיות נוכחים. זה כדי למנוע זיהום של זן RIDL וזיהום עם פתוגנים שעלולים להשפיע על כושר והישרדות, הפחתת הפרודוקטיביות והיעילות של גברים משוחררים. 3. עיצוב חרקים איור 2 מציג תוכנית של חרקים המשמשים בביופאבריקה מוסקאם בברזיל. הטמפרטורה של כל החדרים הייתה 26 מעלות צלזיוס ± 2) עם לחות יחסית כ 70 – 80% ו 12: 12 שעות אור: מחזור כהה באמצעות רצועות אור פלואורסצנטי. ניתן לשנות תוכנית זו בהתאם לדרישות שטח ספציפיות, למשל קנה המידה של המהדורה יקבע את הגודל הכולל. עם זאת ייצור הביצים, גידול ומיון, בקרת איכות (QC) ושחרורים יש להפריד לארבעה תחומים נפרדים: מושבת ייצור ביצים, ייצור שחרור, QC, ואחסון למבוגרים לשחרור. חדר מושבת ייצור הביצים (כ-20מ’)משמש לייצור ביצים לייצור ביצים. אזור בקרת האיכות הוא המקום בו נערכים ניסויים לבדיקת נהלים וכושר קו RIDL כולל מדידות של קצב הצוהר, מספרי גולם, גודל גולם ומדידת האפקטיביות של מיון והסרת נקבות. בדיקות נערכות גם עבור זיהום WT על ידי בדיקת נוכחות של סמן פלואורסצנטי ופנוטיפ באמצעות מבחני קיזוז מדידת קטלניות. חדר יצירת השחרור (כ 36 מ’2)דורש מקום הולם עבור מגשים מיון של זחלים וגולם. המגשים מוחזקים במדפי אלומיניום ייעודיים. אזור עבודה וכיור גדולים נדרשים לגידול ומיון וכיור גדול נוסף נדרש לשטיפת מגשים וכלובים. מלכודת תפיסת מסנן נכללה בשקע מי השפכים מהכיורים כדי למתן את הבריחה של יתושים חיים דרך הביוב. כל המים המשמשים את המגשים הוא השליך דרך ניקוז, אשר יש תא המכיל רשת המונעת בריחה של חרקים בכל שלב של התפתחות. אזור נדרש לאחסון מבוגרים לשחרור (אחסון למבוגרים לשחרור, איור 2)המכיל ארון תקשורת להחזקת התקני השחרור בזמן שהמבוגרים מתבגרים לפני השחרור. שיטות ייצור לגידול המוני RIDL: מושבת ייצור הביצים מייצרת את הביצים המשמשות בדור השחרור (איור 1) לייצור מבוגרים. ישנם קווי דמיון רבים בשתי שיטות גידול אבל גם כמה הבדלים ברורים. תהליכי גידול זהים עבור שני ההליכים מתוארים בסעיף מושבת ייצור הביצים בלבד. מושבת ייצור ביצים 4. ייצור זחל מושבת ייצור הביצים מייצרת ביצי OX513A RIDL הומוזיגיות8 לדור השחרור. בקרת איכות גבוהה מבטיחה כדאיות, כושר ושלמות מאמץ של הביצים המסופקות. הגירוי לבקיעה הוא שקיעה במים עם רמה נמוכה של חמצן מומס. כדי להפחית את רמת החמצן במים, מחממים מים עד שהם רותחים ומיד מניחים 400 מ”ל לתוך 500 מ”ל צנצנות זכוכית (74 מ”מ פתיחת היקף), להדק את המכסה בבטחה ולהשאיר בטמפרטורת החדר במשך כמה שעות כדי להתקרר. שים 1 גרם של ביצים לתוך צנצנת של מים רותחים, reseal ולחכות שעה. מעבירים את התכולה למגש עם 2 ליטר מים ומשאירים לילה בתנאים חרקים. מניחים את הזחלים שבקעו לתוך נפח ידוע של מים ומערבבים באמצעות stirrer מגנטי פרעושים מספיק זמן לקחת aliquots; ערבוב נמרץ או לזמן ממושך פוגע בזחלים ויש לשמור אותם למינימום. הנפח הסטנדרטי המשמש לבקוע זחלים הוא 1 L, אולם צפיפות של יותר מ 300 זחלים / מיליליטר קשה לספור ועלול להזיק. לכן לא בוקעים יותר מ 300,000 ביצים / ליטר מים. לקבוע את קצב הצוהר על ידי לקיחת שלושה 1 מיליליטר aliquots והנחת על גיליון של נייר סופג, עם רשת של 1 ס”מ ריבועים, על גבי ספוג סופג כדי לספוג את כל המים העודפים.  לספור את מספר הביצים בקעו ללא מים משלושה ריבועים על ידי מחפש את הכובע החסר של ביצה בקעה. צפוי שיעור צוהר סביב 80-90%. קח ארבעה aliquots של 1 מיליליטר כל מקום לתוך ארבע סירות שחורות לשקול (זחלים הם לבנים ולכן גלוי יותר על רקע שחור) ולספור את מספר הזחלים החיים נוכח בעין; מומלץ להשתמש במונה. המספר הממוצע של זחלים למ”ל משמש לאחר מכן כדי לחשב את נפח המים להוסיף על כל מגש כדי לקבל את המספר הרצוי של זחלים למגש. יכולים להיות הבדלים גדולים בצפיפות שבה ניתן לגדל זחלים בין זנים ומינים. רצוי גם להשוות את גודל הזכר הבוגר RIDL לזכרים מסוג פראי; באופן אידיאלי אתה רוצה דומה זכרים RIDL בגודל גדול יותר שיכול להתחרות בהצלחה עם זכרים פראיים. לכן עבור כל זן RIDL הצפיפות האידיאלית של זחלים צריך להיקבע והוא פשרה נגד אילוצי שטח לגידול ואת קנה המידה של הייצור. צפיפויות הנעות בין 0.1-2.5 זחלים /מיליליטר מצאנו להיות שילוב טוב של תפוקת ייצור ואיכות; נדון גם על ידי מדיצ’י23. מוסיפים את הזחלים למגשים. במתקן שלנו אנו משתמשים במגשים בגודל של כ 53 ס”מ x 37 ס”מ x 8 ס”מ (L x W x H) ואת כמות המים הנדרשת כדי להשיג את צפיפות הזחלים לייצור. הוסף תמיסת מלאי של טטרציקלין (3 מ”ג / מ”ל במים) למגשים בדילול 1:100 כדי להשיג את הריכוז הסופי הנדרש של 30 מיקרוגרם / מיליליטר. להאכיל זחלים עם מזון דגים פתיתים(www.sera.de)מדי יום, אשר נמחץ אבקה דקה. טבלה 1 מציגה את משטר ההאכלה הטיפוסי במ”ג מזון לזחלים ליום. להאכיל זחלים עד היום המתאים של מיון בתנאים חרקים שתוארו לעיל. 5. מיון זחלים מגפם וגלפות זכר/נקבה מיין זחלים מגפם 8 ימים לאחר הבקיעה על ידי הפרדת הזחלים מהגלמים. ואז סקס ממיין את הגומי לזכרים. מכשיר המכונה מפריד לוחות24,25 יכול למיין זחלים מגול זכר ומן הגומי הנשי. איור 3 ממחיש את השימוש במפריד לוחות זה כדי להפריד זחלים מהזכר ומהגלמים הנשיים. באמצעות כף מדידה עם רשת בתחתית, לכייל אותו עם 500 גולמים או יותר ולהשתמש בו כדי להגדיר כלובים ולהעריך את הכמות הכוללת של זכרים ונקבות גולם המיוצר. ביום הראשון של המיון (יום 8) רוב הגומים הם זכרים, אז הניחו את הזחלים הממוינים בחזרה למגש ואחוריים עד למחרת כאשר רוב הגומים הם נקבות(איור 4). חזור על תהליך המיון בכל יום כמתואר בשלבים 2.1-2.3 עד שכל הזחלים יצוצו או עד סוף שבוע עבודה. מניחים 1,000 גולם זכר (באמצעות כף המדידה) בכלוב וביום 9 מוסיפים 3,000 גולם נקבה לאותו כלוב (אנו משתמשים בצינורות PVC בגובה 30 ס”מ ובקוטטר 30 ס”מ המותאמים עם חולצת רשת וחור גישה מרושת, אך כלובי פלסטיק בגודל 30 ס”מ x 30 ס”מ זמינים גם מ- BugDorm). אפשר למבוגרים להזדווג לפחות 2 ימים ולספק להם פתרון סוכרוז (10%) על ליביטום מודעת כותנה רטובה לפני האכלת דם. לאסוף ביצים במשך שבועיים (~ שני מחזורים gonotrophic) עם שתי הזנות דם בשבוע. זה מניב בממוצע 143,000 ביצים מכלוב של 3,000 נקבות (ממוצע של 48 ביצים / נקבה). לייצור 4 מיליון ביצים בשבוע יש להקים כ-28 כלובים מדי שבוע. 6. האכלת דם מערכת הזנת צלחת אלומיניום מספקת לכלובים דם פעמיים בשבוע. כיס דם נוצר בצד צלחת אלומיניום (10 ס”מ x 10 ס”מ x 3 מ”מ) עם Parafilm (איור 5). כדי לעודד האכלה, הדם מתחמם על ידי הנחת שקית שעועית מחוממת על גבי מאכיל צלחת. שקית שעועית כללה כ 250 גרם של גרגרי חיטה בשקית בד, אשר מחומם במשך כ 10 שניות במיקרוגל. הדם שאנו משתמשים בו להאכלה הוא מבית מטבחיים מקומי; כמו בעלי חיים אלה (בעיקר עזים וכבשים) הם לצריכה אנושית הם נבדקים כדי למנוע נוכחות של פתוגנים. שלושה ימים לאחר האכלת הדם, מסופק אתר הנחה לנקבות להטיל את ביציהן. אתר oviposition הוא מיכל פלסטיק עגול מלא בערך 1/4 עם מים ונייר סינון המכסה את החלק הפנימי. יומיים לאחר מכן האתר הוסר. לייצור ביצים מקסימלי, ודאו שנייר המסנן מכסה את כל המשטח הזמין בתוך המיכל ונשאר רטוב. מוציאים את נייר הביצה ומניחים על נייר סופג לייבוש בתנאים חרקים; ביצים דורשות תקופה של התניה בלחות גבוהה (מעל 70%) של לפחות 48 שעות לאחר שהונח. ביצים ניתן להשאיר חרקים עד 3 חודשים עם ירידה מינימלית בקצב הצוהר, כל עוד הלחות נשמרת גבוה25. מושבת ייצור הביצים צריכה להיות בגודל מספיק כדי לספק את מספר הביצים הנדרש על בסיס שבועי לתוכנית השחרור. המתקן המתואר לעיל יכול לייצר כ -4 מיליון ביצים עם 28 כלובים שהוקמו מדי שבוע. מומלץ לשמור מספיק ביצים מאוחסנות כדי להבטיח לפחות 4 שבועות של ביצים לייצור ייצור שחרור מושבה לייצור ביצים. הפקת מהדורה 7. ייצור זחלים תהליכי הבקיעה, ההגדלה והמיון של דור השחרור זהים לשיטה שתוארה קודם לכן למושבת ייצור הביצים. עם זאת, היקף הייצור הוא הרבה יותר גדול וזה דורש יותר מגשים ומאמץ נוסף. 8. מיון זחלים, גולם זכר, ו נקבת גולם המיון של זחלים, גולם זכר וגומה נקבית זהה לשיטה המתוארת לייצור ביצים. לאחר מיון הגומה הגברית חשוב לבדוק זיהום נשי לפני השחרור; לא צריך להיות יותר מ 1% נקבות נוכחים. קח שלושה aliquots של 500 גולם (שלוש כפות מדידה אקראיות גולם) ולספור את מספר הגומי הנשי הנוכחי. ניתן לזהות נקבות מכיוון שהן בדרך כלל גדולות יותר מהזכרים ומהבדלים בצורת האונה של איברי המין (איור 6)27. אם יש יותר מ 1% נקבות הם צריכים להזדקק ולבדוק שוב. השתמש רק הזכרים מהיום 8 ו 9 לשחרור; אוטוקלאב כל הזחלים והגלמי הנותרים. בברזיל, יש להתייחס לפסולת זו באותו אופן כמו פסולת רפואית, אך התקנות עשויות להיות שונות במדינות אחרות. אין להשתמש בגלפים ובזחלים נשיים מדור השחרור למושבת ייצור הביצים בשל הבדלים בבקרת האיכות, בגידול ובזיהום ממספרים גדולים יותר ובבקרת איכות נמוכה יותר. אחסון למבוגרים לשחרור: הכניסו גברים למכשירי שחרור כדי שיצצו ויתבגרו לפני השחרור. פרטי התקני ההפצה אינם מכוסים בשיטה זו. עם זאת, הקיבולת של מכשירי השחרור שאנו משתמשים בהם היא כ-1,000 זכרים. פרטי שיטת ההפצה (התקן הפצה ומערכת הפצה) אינם מכוסים בשיטה זו.