Brezilya'da Saha Sürümleri için Genetiği Değiştirilmiş Aedes aegypti'nin Seri Üretimi

Böcek Gereksinimleri 1. Genel Bakış Kütle yetiştirme, her biri kütle yetiştirme ünitesinin ayrı bir alanında gerçekleştirilen birkaç aşamaya sahiptir. Şekil 1, yetiştirmenin ana aşamasını ve toplu yetiştirme tesisinde nerede meydana geldiklerini göstermektedir. 2. Böcekçi için Biyogüvenlik Hususları Proje, Brezilya São Paulo Üniversitesi’nden hayvan etiği komitesi tarafından onaylandı ve gerekli tüm izinler ve onaylar alındı. RIDL sistemi koşullu öldürücülük kullanır; bir diyet takviyesi (tetrasiklin), böceklerin kitlesel olarak yetiştirilmesine izin vererek RIDL sisteminin ifadesini önler; tetrasiklin olmadan sivrisinekler ölür. Tetrasiklin, vahşi doğada Ae. aegypti üreme alanlarında bulunmaz, bu nedenle kaçaklardan üretilen herhangi bir yavru hayatta kalamaz.  Bu, diğer yöntemlerle(yani radyasyon) sterilize edilen vahşi tip (WT) böcekleri kullanma konusunda ekstra bir güvenlik seviyesi ekler. Böcek ilacında çift kapılı giriş, “Sadece Yetkili Personel” işaretleri ve böcek ekranları kullanın. Koloninin WT böcekleri ile kirlenmesini önlemek ve böcek ilacının içinden kaçışları önlemeye yardımcı olmak için herhangi bir pencere kapatılmalıdır. Yerel yönetmeliklerin ve yetkililerin belirli ek veya alternatif gereksinimleri olabilir. Erken bir aşamada bilgi / rehberlik için ilgili makamlarla iletişime geçin ve RIDL suşunu bir böcek ilacında kurmadan önce gerekli tüm izinleri ve onayları güvence altına alın. Kütle yetiştirme insektisiti sadece RIDL yetiştirme için kullanılmalıdır. Başka hiçbir suş veya böcek bulunmamalıdır. Bu, RIDL suşu ve kirlenmesinin fitness ve hayatta kalmayı etkileyebilecek patojenlerle kirlenmesini önlemek, serbest bırakılan erkeklerin verimliliğini ve etkinliğini azaltmaktır. 3. Böcek Tasarımı Şekil 2, Brasil’deki Biofábrica Moscamed’de kullanılan böcek ilacının bir planını göstermektedir. Tüm odaların sıcaklığı 26 °C ± 2) idi ve yaklaşık% 70-80 bağıl nem ve floresan ışık şeritleri kullanılarak 12:12 saat ışık: karanlık döngü. Bu şema belirli alan gereksinimlerine göre değiştirilebilir, örneğin sürümün ölçeği genel boyutu belirleyecektir. Bununla birlikte, yumurta üretimi, yetiştirme ve ayıklama, Kalite Kontrol (QC) ve serbest bırakmalar dört ayrı alana ayrılmalıdır: Yumurta Üretim Kolonisi, Serbest Bırakma Üretimi, QC ve Serbest Bırakma için Yetişkin Depolama. Yumurta Üretim Kolonisi odası (yaklaşık 20 m2)salınım üretimi için yumurta üretmek için kullanılır. Kalite Kontrol alanı, tarama oranı, pupa sayıları, pupa boyutu ve kadınların sıralanma ve çıkarılmasının etkinliğinin ölçülmesi de dahil olmak üzere PROSEDÜRLERI ve RIDL hattının uygunluğunu kontrol etmek için deneylerin yapıldığı yerdir. WT kontaminasyonu için testler, ölümcüllüğü ölçen ofset tahlilleri kullanılarak floresan belirteci ve fenotip bunların varlığını kontrol ederek de yapılır. Serbest Bırakma Oluşturma odası (yaklaşık 36 m2),tepsiler ve larva ve pupaların sıraya dizilimi için yeterli alan gerektirir. Tepsiler amaca uygun alüminyum raflarda tutulur. Yetiştirme ve ayıklama için geniş bir çalışma alanı ve lavabo, tepsilerin ve kafeslerin yıkanması için ise başka bir büyük lavabo gereklidir. Canlı sivrisineklerin kanalizasyondan kaçışını azaltmak için lavabolardan atık su çıkışına bir filtre yakalama tuzağı dahil edilmiştir. Tepsiler için kullanılan tüm su, gelişimin herhangi bir aşamasında böceklerin kaçmasını önleyen bir ağ içeren bir bölmeye sahip bir drenajdan atılır. Yetişkinler serbest bırakılmadan önce olgunlaşırken serbest bırakma cihazlarını tutmak için raf içeren serbest bırakma için yetişkinlerin depolanmasının bir alanı gereklidir (Serbest Bırakma için Yetişkin Depolama, Şekil 2). Toplu Yetiştirme RIDL için Üretim Yöntemleri: Yumurta Üretim Kolonisi, yetişkinleri üretmek için Salınım Üretimi ‘nde (Şekil 1) kullanılan yumurtaları üretir. İki yetiştirme yönteminde birçok benzerlik vardır, aynı zamanda bazı belirgin farklılıklar vardır. Her iki prosedür için de aynı olan yetiştirme işlemleri sadece Yumurta Üretim Kolonisi bölümünde açıklanmıştır. Yumurta Üretim Kolonisi 4. Larva Üretimi Yumurta Üretim Kolonisi, Salınım Üretimi için homozigous OX513A RIDL yumurta8 üretir. Yüksek kalite kontrolü, sağlanan yumurtaların canlılığını, zindeliğini ve gerinim bütünlüğünü sağlar. Kuluçka için uyaran, düşük çözünmüş oksijen seviyesine sahip suya batırılmasıdır. Sudaki oksijen seviyesini azaltmak için suyu kaynayana kadar ısıtın ve hemen 400 ml’yi 500 ml cam kavanozlara (74 mm açıklık çevresi) yerleştirin, kapağı güvenli bir şekilde sabitleyin ve soğuması için birkaç saat oda sıcaklığında bırakın. Bir kavanoz kaynamış suya 1 g yumurta koyun, yeniden alın ve bir saat bekleyin. İçeriği 2 L su ile bir tepsiye aktarın ve böcek koşulları altında gece boyunca bırakın. Yumurtadan çıkan larvaları bilinen bir su hacmine yerleştirin ve aliquots almak için yeterli zaman için manyetik bir karıştırıcı ve pire kullanarak karıştırın; kuvvetlice veya uzun süre karıştırmak larvalara zarar verir ve minimumda tutulmalıdır. Larvaları taramak için kullanılan standart hacim 1 L’dir, ancak 300’den fazla larva / ml’den fazla yoğunlukların sayılması zordur ve zarar verici olabilir. Bu nedenle yaklaşık 300.000 yumurta / L’den fazla su yumurtadan çıkmayın. Üç adet 1 ml aliquot alarak ve fazla suyu emmek için emici bir süngerin üzerine 1 cm karelik bir ızgara ile emici bir kağıda yerleştirerek tarama oranını belirleyin.  Yumurtadan çıkmış ve taranmamış yumurtanın sayısını üç kareden, yumurtadan çıkmış bir yumurtanın eksik kapağını arayarak sayın. -90 civarında bir tarama oranı beklenmektedir. Her biri 1 ml’lik dört aliquot alın ve dört siyah ağırlık teknesine yerleştirin (larvalar beyazdır ve bu nedenle siyah bir arka plana karşı daha kolay görülebilir) ve gözle bulunan canlı larva sayısını sayın; sayaç kullanılması önerilir. Ml başına ortalama larva sayısı daha sonra tepsi başına istenen sayıda larva elde etmek için her tepsiye eklenecek su hacmini hesaplamak için kullanılır. Larvaların suşlar ve türler arasında yetiştirilebileceği yoğunlukta büyük farklılıklar olabilir. RIDL yetişkin erkek boyutunu vahşi tip erkeklerle karşılaştırmak da arzu edilir; ideal olarak, vahşi erkeklerle başarılı bir şekilde rekabet edebilecek daha büyük boyutlu RIDL erkeklerine benzer olmak istersiniz. Bu nedenle, her RIDL suşu için larvaların ideal yoğunluğunun belirlenmesi gerekir ve yetiştirme ve üretim ölçeği için alan kısıtlamalarına karşı bir takastır. 0.1-2.5 larva / ml arasında değişen yoğunluklar, üretim çıktısı ve kalitesinin iyi bir kombinasyonu olduğunu gördük; ayrıca Medici tarafından tartışıldı23. Larvaları tepsilere ekleyin. Tesisimizde üretim için larva yoğunluğunu sağlamak için yaklaşık 53 cm x 37 cm x 8 cm (L x W x H) ve gerekli miktarda su içeren tepsiler kullanıyoruz. Gerekli 30 μg/ ml’lik son konsantrasyonu elde etmek için tepsilere 1:100 seyreltmede bir tetrasiklin (suda 3 mg / ml) stok çözeltisi ekleyin. Larvaları, ince bir toz haline getirilmiş pul balık yemi(www.sera.de)ile besleyin. Tablo 1, larva başına günlük gıda mg’ında tipik beslenme rejimini gösterir. Larvaları yukarıda açıklanan böcek koşulları altında uygun sıralama gününe kadar besleyin. 5. Larvaları Pupa ve Erkek / Dişi Pupalardan Sıralama Larvaları pupalardan ayırarak kuluçkadan 8 gün sonra pupalardan sıralayın. Sonra erkekler için pupaları seksle sıralayın. Plaka ayırıcısı 24,25 olarak bilinen bir cihaz larvaları erkek pupalardan ve dişi pupalardan sıralayabilir. Şekil 3, larvaları erkekten ve dişi pupalardan ayırmak için bu plaka ayırıcının kullanımını göstermektedir. Altta bir ağ olan bir ölçüm kaşığı kullanarak, 500 pupa veya daha fazla ile kalibre edin ve kafesler kurmak ve üretilen toplam erkek ve dişi pupa miktarını tahmin etmek için kullanın. Sıralamanın ilk gününde (8. gün) pupaların çoğu erkektir, bu nedenle sıralanmış larvaları bir tepsiye geri yerleştirin ve pupaların çoğunun dişi olduğu ertesi güne kadar arka tarafa yerleştirin (Şekil 4). Sıralama işlemini her gün 2.1-2.3 adımlarında açıklandığı gibi, tüm larvalar yavrulanana kadar veya bir çalışma haftasının sonuna kadar tekrarlayın. Bir kafese 1.000 erkek pupa (ölçü kaşığını kullanarak) yerleştirin ve 9. günde aynı kafese 3.000 dişi pupa ekleyin (örgü üst ve ağlı erişim deliği ile uyarlanmış 30 cm yüksekliğinde ve 30 cm çapında PVC borular kullanıyoruz, ancak BugDorm’dan 30 cm x 30 cm plastik kafesler de mevcuttur). Yetişkinlerin en az 2 gün çiftleşmelerine izin verin ve onlara sakkaroz çözeltisi sağlayın () kan beslemeden önce ıslak pamuklu reklam libitumunda. Haftada iki kan yemi ile iki hafta (~ iki gonotrofik döngü) yumurta toplayın. Bu, 3.000 dişilik bir kafesten (ortalama 48 yumurta / dişi) ortalama 143.000 yumurta verir. Haftada 4 milyon yumurta üretimi için her hafta yaklaşık 28 kafes kurulması gerekir. 6. Kan Besleme Alüminyum plaka besleme sistemi kafeslere haftada iki kez kan sağlar. Parafilmli bir alüminyum plakanın (10 cm x 10 cm x 3 mm) yanında bir kan cebi oluşturulur (Şekil 5). Beslenmeyi teşvik etmek için, plaka besleyicinin üzerine ısıtılmış bir fasulye torbası yerleştirilerek kan ısıtılır. Fasulye torbası, bir mikrodalga fırında yaklaşık 10 saniye ısıtılan bir bez torbada yaklaşık 250 g buğday tanelerinden oluşuyordu. Beslenme için kullandığımız kan yerel bir sitoirden; Bu hayvanlar (özellikle keçiler ve koyunlar) insan tüketimi için olduğu için patojenlerin varlığını önlemek için test edilirler. Kan beslemeden üç gün sonra, dişilerin yumurtalarını bırakmaları için bir yumurtlama alanı sağlanır. Yumurtlama bölgesi, içini kaplayan su ve filtre kağıdı ile yaklaşık 1/4’e doldurulmuş yuvarlak bir plastik kaptır. İki gün sonra yumurtlama yeri kaldırılır. Maksimum yumurta üretimi için, filtre kağıdının kabın içindeki mevcut yüzeyin tamamını kapladığından ve ıslak kaldığından emin olun. Yumurta kağıdını çıkarın ve böcek koşullarında kurumak için emici kağıda yerleştirin; yumurtalar yüksek nemde (‘in üzerinde) bir şartlanma süresi gerektirir en az 48 saat sonra döşenir. Yumurtalar, nem yüksek tutulduğu sürece, kuluçka oranında minimum düşüşle3aya kadar böcek ilacı içinde bırakılabilir. Yumurta üretim kolonisinin, serbest bırakma programı için haftalık olarak gerekli olan yumurta sayısını sağlamak için yeterli boyutta olması gerekir. Yukarıda açıklanan tesis, haftada 28 kafes ile yaklaşık 4 milyon yumurta üretebilir. Salınım Üretimi ve Yumurta Üretim Kolonisi için en az 4 haftalık yumurtayı garanti edecek kadar yumurtanın saklanması önerilir. Sürüm Oluşturma 7. Larva Üretimi Salınım üretimi için tarama, yetiştirme ve sıralama işlemleri, Yumurta Üretim kolonisi için daha önce açıklanan yöntemle aynıdır. Bununla birlikte, üretim ölçeği çok daha büyüktür ve bu daha fazla tepsi ve daha fazla çaba gerektirir. 8. Larvaları, Erkek Pupaları ve Dişi Pupaları Sıralama Larvaların, erkek pupaların ve dişi pupaların sıraya dizilişleri Yumurta Üretimi için açıklanan yöntemle aynıdır. Erkek pupaları sıraladıktan sonra, serbest bırakılmadan önce kadın kontaminasyon olup olmadığını kontrol etmek önemlidir; % 1’den fazla kadın olmamalıdır. 500 pupadan üç aliquot alın (üç rastgele pupa ölçüm kaşığı) ve mevcut dişi pupa sayısını sayın. Dişiler genellikle erkeklerden daha büyük oldukları ve genital lob şeklindeki farklılıklardan tanımlanabilirler (Şekil 6)27. % 1’den fazla kadın varsa, tekrar başvurulmalı ve kontrol edilmelidir. Serbest bırakmak için sadece 8 ve 9. kalan larvaları ve pupaları otoklav. Brezilya’da, bu atık tıbbi atıklarla aynı şekilde ele alınmalıdır, ancak düzenlemeler diğer ülkelerde farklılık gösterebilir. Kalite kontrol, yetiştirme ve kontaminasyon risklerindeki farklılıklar, daha büyük sayılardan ve daha düşük kalite kontrolü nedeniyle Yumurta Üretim Kolonisi için Salınım Neslinden dişi pupa ve larvalar kullanmayın. Serbest Bırakma için Yetişkin Depolama: Erkekleri serbest bırakılmadan önce ortaya çıkmak ve olgunlaşmak için serbest bırakma cihazlarına yerleştirin. Serbest bırakma cihazlarının ayrıntıları bu yöntemde ele alınmaz. Ancak kullandığımız serbest bırakma cihazlarının kapasitesi 1.000 erkek civarındadır. Sürüm yöntemi ayrıntıları (sürüm cihazı ve sürüm sistemi) bu yöntemde ele alınmaz.