Producción masiva de Aedes aegypti genéticamente modificados para liberaciones de campo en Brasil

Requisitos insectarios 1. Visión general La cría en masa tiene varias fases, cada una de las cuales se realiza en un área distinta de la unidad de cría en masa. La Figura 1 muestra la fase principal de la cría y dónde se producen en la instalación de cría masiva. 2. Consideraciones de bioseguridad para los insectarios El proyecto fue aprobado por el comité de ética animal de la Universidad de São Paulo – Brasil y se obtuvieron todos los permisos y aprobaciones necesarias. El sistema RIDL utiliza la letalidad condicional; un suplemento dietético (tetraciclina) impide la expresión del sistema RIDL permitiendo que los insectos sean criados en masa; sin tetraciclina los mosquitos mueren. La tetraciclina no se encuentra en los sitios de reproducción de Ae. aegypti en la naturaleza, por lo que cualquier descendencia producida por fugitivos no sobrevivirá.  Esto agrega un nivel adicional de seguridad sobre el uso de insectos de tipo salvaje (WT) esterilizados por otros métodos(es decir, radiación). Use la entrada de doble puerta, letreros de “Solo personal autorizado” y mosquiteros en el insectario. Cualquier ventana debe estar sellada para evitar la contaminación de la colonia con insectos WT y ayudar a prevenir escapes desde el interior del insectario. Las regulaciones y autoridades locales pueden tener requisitos adicionales o alternativos específicos. Póngase en contacto con las autoridades pertinentes para obtener información o orientación en una etapa temprana, y obtener todos los permisos y aprobaciones necesarios antes de establecer la cepa RIDL en un insectario. La cría masiva insectaria sólo debe utilizarse para la cría de RIDL. No hay otras cepas o insectos deben estar presentes. Esto es para evitar la contaminación de la cepa RIDL y la contaminación con patógenos que pueden afectar la aptitud y la supervivencia, reduciendo la productividad y la eficacia de los machos liberados. 3. Diseño insectario La Figura 2 muestra un plano del insectario utilizado en biofábrica Moscamed en Brasil. La temperatura de todas las habitaciones fue de 26 °C ± 2) con una humedad relativa de aproximadamente 70-80% y un ciclo de luz: oscuridad de 12:12 horas utilizando tiras de luz fluorescente. Este plano se puede modificar de acuerdo con los requisitos de espacio específicos, por ejemplo, la escala de la versión determinará el tamaño total. Sin embargo, la producción, la cría y clasificación de huevos, el control de calidad (QC) y las liberaciones deben separarse en cuatro áreas distintas: colonia de producción de huevos, generación de liberación, control de calidad y almacenamiento de adultos para su liberación. La sala de la Colonia de Producción de Huevos (aproximadamente 20 m2)se utiliza para producir huevos para la generación de liberación. El área de Control de Calidad es donde se llevan a cabo experimentos para verificar los procedimientos y la aptitud de la línea RIDL, incluidas las mediciones de la tasa de eclosión, el número de pupas, el tamaño de la pupa y la medición de la efectividad de la clasificación y eliminación de hembras. También se realizan pruebas para la contaminación por WT mediante la comprobación de la presencia de marcador de fluorescencia y fenotipo utilizando ensayos de compensación que miden la letalidad. La sala de Generación de Liberación (aproximadamente 36 m2)requiere espacio adecuado para bandejas y la clasificación de larvas y pupas. Las bandejas se mantienen en bastidores de aluminio especialmente diseñados. Se requiere un gran área de trabajo y un fregadero para la crianza y clasificación y otro fregadero grande para el lavado de bandejas y jaulas. Se ha incluido una trampa de captura de filtro en la salida de aguas residuales de los sumideros para mitigar el escape de mosquitos vivos a través de la alcantarilla. Toda el agua utilizada para las bandejas se dispone a través de un desagüe, que cuenta con un compartimento que contiene una malla que evita el escape de insectos en cualquier etapa del desarrollo. Se requiere un área para el almacenamiento de adultos para su liberación (Almacenamiento de adultos para liberación, Figura 2)que contiene estanterías para contener los dispositivos de liberación mientras los adultos maduran antes de la liberación. Métodos de producción para la cría en masa ridl: La Colonia de Producción de Huevos produce los huevos que se utilizan en la Generación de Liberación(Figura 1)para producir adultos. Hay muchas similitudes en los dos métodos de cría, pero también algunas diferencias claras. Los procesos de cría que son los mismos para ambos procedimientos se describen en la sección Colonia de producción de huevos solamente. Colonia de Producción de Huevos 4. Producción larvaria La Colonia de Producción de Huevos genera huevos OX513A RIDL homocigóticos8 para la Generación de Liberación. Un alto control de calidad garantiza la viabilidad, la aptitud y la integridad de la cepa de los huevos suministrados. El estímulo para la eclosión es la inmersión en agua con un bajo nivel de oxígeno disuelto. Para reducir el nivel de oxígeno en el agua, calentar el agua hasta que hierva e inmediatamente colocar 400 ml en frascos de vidrio de 500 ml (circunferencia de apertura de 74 mm), sujetar la tapa de forma segura y dejar a temperatura ambiente durante varias horas para enfriar. Poner 1 g de huevos en un frasco de agua hervida, volver a sesgar y esperar una hora. Transferir el contenido a una bandeja con agua de 2 L y dejar pasar la noche en condiciones insectarias. Coloque las larvas eclosionadas en un volumen conocido de agua y revuelva usando un agitador magnético y pulgas durante el tiempo suficiente para tomar alícuotas; agitar vigorosamente o durante un tiempo prolongado daña las larvas y debe mantenerse al mínimo. El volumen estándar utilizado para eclosionar larvas es de 1 L, sin embargo, las densidades de más de 300 larvas / ml son difíciles de contar y pueden ser perjudiciales. Por lo tanto, no eclosione más de unos 300.000 huevos/L de agua. Determine la velocidad de eclosión tomando tres alícuotas de 1 ml y colocándolas sobre una hoja de papel absorbente, con una rejilla de 1 cm cuadrados, encima de una esponja absorbente para absorber el exceso de agua.  Cuente el número de huevos eclosionados y no incubados de tres cuadrados buscando la tapa faltante de un huevo eclosionado. Se espera una tasa de eclosión alrededor del 80-90%. Tomar cuatro alícuotas de 1 ml cada una y colocar en cuatro botes de pesaje negros (las larvas son blancas y por lo tanto más fácilmente visibles sobre un fondo negro) y contar el número de larvas vivas presentes por el ojo; se recomienda el uso de un contador. El número promedio de larvas por ml se utiliza para calcular el volumen de agua a añadir en cada bandeja para obtener el número deseado de larvas por bandeja. Puede haber grandes diferencias en la densidad en la que se pueden criar las larvas entre cepas y especies. También es deseable comparar el tamaño de macho adulto RIDL con los machos de tipo salvaje; idealmente quieres similar a los machos RIDL de mayor tamaño que pueden competir con éxito con los machos salvajes. Por lo tanto, para cada cepa ridl es necesario determinar la densidad ideal de larvas y es una compensación contra las limitaciones de espacio para la cría y la escala de producción. Densidades que van desde 0.1-2.5 larva/ml hemos encontrado para ser una buena combinación de producción y calidad; también discutido por Medici23. Añadir las larvas a las bandejas. En nuestras instalaciones utilizamos bandejas de unos 53 cm x 37 cm x 8 cm (L x W x H) y la cantidad de agua necesaria para lograr la densidad de larvas para la producción. Añadir una solución común de tetraciclina (3 mg/ml en agua) a las bandejas a una dilución de 1:100 para obtener la concentración final requerida de 30 μg/ml. Alimente a las larvas con alimentos de peces en escamas(www.sera.de)diariamente, que han sido triturados en un polvo fino. La Tabla 1 muestra el régimen de alimentación típico en mg de alimento por larva y día. Alimentar a las larvas hasta el día apropiado de clasificación en las condiciones insectarias descritas anteriormente. 5. Clasificación de larvas de pupas y pupas macho /hembra Clasificar las larvas de las pupas 8 días después de la eclosión separando las larvas de las pupas. Entonces sexo-ordene las pupas para los varones. Un dispositivo conocido como separador de placas24,25 puede clasificar larvas de pupas macho y de pupas hembras. La Figura 3 ilustra el uso de este separador de placas para separar las larvas de las pupas masculinas y femeninas. Usando una cuchara de medición con una malla en la parte inferior, calibrarla con 500 pupas o más y usarla para establecer jaulas y estimar la cantidad total de pupas de machos y hembras producidas. En el primer día de clasificación (día 8) la mayoría de las pupas son machos, así que coloque las larvas clasificadas de nuevo en una bandeja y vuelva a la parte posterior hasta el día siguiente, cuando la mayoría de las pupas son hembras (Figura 4). Repita el proceso de clasificación cada día como se describe en los pasos 2.1-2.3 hasta que todas las larvas hayan pupado o hasta el final de una semana laboral. Coloque 1.000 pupas macho (usando la cuchara de medida) en una jaula y el día 9 agregue 3.000 pupas hembras a la misma jaula (usamos tubos de PVC de 30 cm de alto y 30 cm de diámetro adaptados con malla superior y un orificio de acceso con red, pero las jaulas de plástico de 30 cm x 30 cm x 30 cm también están disponibles en BugDorm). Permita que los adultos se apareen durante al menos 2 días y proporcionándoles solución de sacarosa (10%) en algodón húmedo ad libitum antes de la alimentación con sangre. Recoja los huevos durante dos semanas (~ dos ciclos gonotróficos) con dos alimentos de sangre a la semana. Esto produce un promedio de 143.000 huevos de una jaula de 3.000 hembras (un promedio de 48 huevos/hembra). Para la producción de 4 millones de huevos a la semana es necesario instalar unas 28 jaulas cada semana. 6. Alimentación de sangre Un sistema de alimentación de placas de aluminio suministra sangre a las jaulas dos veces por semana. Se crea una bolsa de sangre en el lado de una placa de aluminio (10 cm x 10 cm x 3 mm) con Parafilm(Figura 5). Para fomentar la alimentación, la sangre se calienta colocando una bolsa de frijoles calentada en la parte superior del alimentador de placas. La bolsa de frijoles consistía en aproximadamente 250 g de granos de trigo en una bolsa de tela, que se calienta durante aproximadamente 10 segundos en un microondas. La sangre que usamos para alimentarse es de un matadero local; como estos animales (principalmente cabras y ovejas) son para consumo humano se prueban para evitar la presencia de patógenos. Tres días después de la alimentación con sangre, se proporciona un sitio de oviposición para que las hembras den sus huevos. El sitio de oviposición es un recipiente de plástico redondo lleno de aproximadamente 1/4 con agua y papel de filtro que cubre el interior. Dos días más adelante se quita el sitio de la oviposición. Para obtener la máxima producción de huevos, asegúrese de que el papel de filtro cubra toda la superficie disponible dentro del contenedor y permanezca húmedo. Retire el papel de huevo y colóquelo sobre el papel absorbente para que se seque en condiciones insectarias; los huevos requieren un período de acondicionamiento a alta humedad (más del 70%) de al menos 48 horas después de haber sido puesto. Los huevos se pueden dejar en el insectario durante un máximo de 3 meses con una disminución mínima en la tasa de eclosión, siempre y cuando la humedad se mantenga alta25. La colonia de producción de huevos debe ser de tamaño suficiente para proporcionar el número de huevos requeridos semanalmente para el programa de liberación. La instalación descrita anteriormente puede producir aproximadamente 4 millones de huevos con 28 jaulas establecidas semanalmente. Se recomienda mantener suficientes huevos almacenados para garantizar al menos 4 semanas de huevos para la generación de liberación y la colonia de producción de huevos. Generación de versiones 7. Producción larvaria Los procesos de eclosión, cría y clasificación para la generación de liberación son idénticos al método descrito anteriormente para la colonia de producción de huevos. Sin embargo, la escala de producción es mucho mayor y esto requiere más bandejas y más esfuerzo. 8. Clasificación de larvas, pupas masculinas y pupas femeninas La clasificación de larvas, pupas masculinas y pupas hembras es idéntica al método descrito para la producción de huevos. Después de clasificar las pupas masculinas, es importante verificar la contaminación de las hembras antes de su liberación; no debe haber más del 1% de mujeres presentes. Tome tres alícuotas de 500 pupas (tres pupas aleatorias que miden cucharas) y cuente el número de pupas hembras presentes. Las hembras pueden ser identificadas ya que son generalmente más grandes que los machos y a partir de las diferencias en la forma del lóbulo genital (Figura 6)27. Si hay más del 1% de mujeres, se debe recurrir a ellos y revisar de nuevo. Use solo los machos desde el día 8 y 9 para la liberación; autoclave las larvas y pupas restantes. En Brasil, estos residuos deben ser tratados de la misma manera que los residuos médicos, pero las regulaciones pueden diferir en otros países. No utilice pupas y larvas hembras de la Generación de Liberación para la Colonia de Producción de Huevos debido a las diferencias en el control de calidad, la cría y los riesgos de contaminación de un número mayor, y un menor control de calidad. Almacenamiento de adultos para liberación: Coloque a los machos en dispositivos de liberación para que emerjan y maduren antes de la liberación. Los detalles de los dispositivos de versión no se tratan en este método. Sin embargo, la capacidad de los dispositivos de liberación que utilizamos es de alrededor de 1.000 machos. Los detalles del método de liberación (dispositivo de versión y sistema de liberación) no se tratan en este método.