Органотипической Культура Полная толщина сетчатки взрослых свиней
Summary
Здесь мы опишем экономически эффективный способ органотипической культуру взрослой сетчатке свиней в течение семи дней. Короче говоря, стерильной фильтровальной бумаги была использована для лифта нейронных сетчатку от от ПЭС и место фоторецепторов вверх на вставке поднятых на заказ стенда.
Abstract
Существует спрос на признанных в пробирке моделей, которые могут заменить или уменьшить экспериментах на животных. Свиной сетчатки имеет аналогичную структуру нейронов в сетчатке глаза человека и, следовательно, ценных пород для изучения механизмов сетчатки человека травм и дегенеративных заболеваний. Здесь мы опишем экономически эффективный способ органотипической культуру взрослой сетчатке свиньи изолированы от глаза получена из скотобойни. После удаления переднего сегмента, лезвие трепан была использована для создания нескольких нейронных сетчатки Бруха мембранно-РПЭ-сосудистое-склеры эксплантов из заднего сегмента глаза взрослой свиньи. Кусок стерильной фильтровальной бумаги была использована для лифта нейронных сетчатку от каждого эксплантов. Фильтровальная бумага-сетчатки комплекс культивировали (фоторецепторов стороной вверх) на вершине вставку, которая проходила вдали от нижней части культуры блюдо на заказ стенда. Стенд позволяет для хорошей циркуляции питательной среды по обе стороны от сетчатки. В целом, эта процедура проста, воспроизводимые, и позволяет сохранение родного сетчатки структуры, по крайней мере за семь дней, что делает ее полезной модели для различных морфологических, фармакологических и биохимических исследований на млекопитающих сетчатки.
Protocol
Discussion
Видение исследователи установили различные сетчатки системы культуры, в том числе органотипической систем, для изучения различных вопросов, таких как сетчатки трансплантации стволовых клеток 1, 2 регенерации сетчатки и экзогенных экспрессии генов 3-5. Тем не менее, взрослый…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NIH грант EY 012 031 (ET-), награда от FM Кирби Foundation (ET-), исследований в области профилактики слепоты, Inc (МАЗ), Нью-Джерси Лайонс Ай исследовательский фонд (МАЗ), Eye Institute в Нью-Джерси (МАЗ), Джозеф Дж. и Маргарита DiSepio Retina исследовательского фонда (МАЗ), и Дженис Митчелл Вассар и Эшби Митчелл стипендий (АМК).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| MEM | Invitrogen-Gibco | 10370-021 | |
| 5 mL pipette tip | ISC BioExpress | P-3250-19 | |
| NUNC cell culture insert | Thermal | 137443 | 8μm, Polycarbonate |
| Whatman 4M Filter paper | Whatman | 1004 | |
| DMEM | Cellgro-mediatech Inc | 10-013-CV | |
| Agar | Fluka | 05040 | |
| Fungizone Amphotericin B | Invitrogen-Gibco | 15290018 | |
| Trephine blades | Bausch and Lomb | T3096 | 6.00mm |
| O.C.T. Compound | Electron Microscopy Sciences | 62550-01 | 4583 |
| Sciences | |||
| Cryostat | Leica | CM1900 | |
| Vibratome | Leica | Series 1000 | |
| Confocal microscopy; | Carl Zeiss | LSM510 | |
| Anti-Synaptic Vesicle Protein 2 (SV2) mouse monoclonal antibody | DSHB | N/A | |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) polyclonal rabbit antibody | DAKO | DAKO | |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma | P4170 |
References
- Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 3503-3512 (2008).
- Kretz, A., Marticke, J. K., Happold, C. J., Schmeer, C., Isenmann, S. A primary culture technique of adult retina for regeneration studies on adult CNS neurons. Nat Protoc. 2, 131-140 (2007).
- Donovan, S. L., Dyer, M. A. Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures. Nat Protoc. 1, 2710-2718 (2006).
- Koizumi, A., Zeck, G., Ben, Y., Masland, R. H., Jakobs, T. C. Organotypic culture of physiologically functional adult mammalian retinas. PLoS One. 2, e221-e221 (2007).
- Lye, M. H., Jakobs, T. C., Masland, R. H., Koizumi, A. Organotypic culture of adult rabbit retina. J Vis Exp. , (2007).
- Ames, A., Li, Y. Y., Heher, E. C., Kimble, C. R. Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na+ transport. J Neurosci. 12, 840-853 (1992).
- Kobuch, K. Maintenance of adult porcine retina and retinal pigment epithelium in perfusion culture: characterisation of an organotypic in vitro model. Exp Eye Res. 86, 661-668 (2008).
- Kaempf, S., Walter, P., Salz, A. K., Thumann, G. Novel organotypic culture model of adult mammalian neurosensory retina in co-culture with retinal pigment epithelium. J Neurosci Methods. 173, 47-58 (2008).
- Guduric-Fuchs, J. Immunohistochemical study of pig retinal development. Mol Vis. 15, 1915-1928 (2009).
- Chandler, M. J., Smith, P. J., Samuelson, D. A., MacKay, E. O. Photoreceptor density of the domestic pig retina. Vet Ophthalmol. 2, 179-184 (1999).
