Culture organotypique de pleine épaisseur Retina porcin adultes
Summary
Nous décrivons ici une technique rentable pour la culture organotypique de la rétine porcine adulte pour sept jours. En bref, un papier filtre stérile a été utilisé pour soulever la rétine neurale décollé de l'EPR et le côté photorécepteur lieu sur un insert soulevées par un stand sur mesure.
Abstract
Il ya une demande reconnue pour des modèles in vitro qui peuvent remplacer ou de réduire l'expérimentation animale. Rétine porcin a une structure similaire à la rétine humaine neuronale et est donc une espèce précieuse pour l'étude des mécanismes de blessure rétinienne humaine et les maladies dégénératives. Nous décrivons ici une technique rentable pour la culture organotypique de la rétine porcine adulte isolé yeux obtenue à partir d'un abattoir. Après avoir retiré le segment antérieur, une lame de trépan a été utilisé pour créer de multiples neurones rétine Bruch membrane RPE-choroïde-sclérotique explants du segment postérieur des yeux de porc adulte. Un morceau de papier filtre stérile a été utilisé pour soulever la rétine neurale hors de chaque explant. Le filtre en papier-rétine complexes a été cultivé (côté photorécepteur vers le haut) au sommet d'un insert, qui a eu lieu loin de la bas de la boîte de culture par un stand sur mesure. Le stand permet une bonne circulation du milieu de culture des deux côtés de la rétine. Globalement, cette procédure est simple, reproductible, et permet la préservation de la structure de la rétine natif pour au moins sept jours, ce qui en fait un modèle utile pour une variété d'études morphologiques, pharmacologiques et biochimiques sur la rétine des mammifères.
Protocol
Discussion
Vision chercheurs ont établi une variété de systèmes de culture de la rétine, y compris les systèmes organotypiques, pour étudier une variété de questions, telles que des cellules souches rétiniennes transplantation 1, de la régénération rétinienne 2, et l'expression des gènes exogènes 3-5. Toutefois, les adultes rétine des mammifères est difficile à maintenir in vitro, principalement due à la forte demande en énergie des 6 photorécepteurs. K…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par NIH EY 012 031 (ET-A), un prix décerné par la Fondation FM Kirby (ET-A), de la recherche pour prévenir la cécité, Inc (MAZ), le nouveau maillot des Lions Eye Research Foundation (MAZ), L'Institut de l'oeil du New Jersey (MAZ), le juge Joseph et Marguerite DiSepio Retina Research Fund (MAZ), et l'Janice Mitchell Vassar et Ashby Mitchell Fellowship (AMK).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| MEM | Invitrogen-Gibco | 10370-021 | |
| 5 mL pipette tip | ISC BioExpress | P-3250-19 | |
| NUNC cell culture insert | Thermal | 137443 | 8μm, Polycarbonate |
| Whatman 4M Filter paper | Whatman | 1004 | |
| DMEM | Cellgro-mediatech Inc | 10-013-CV | |
| Agar | Fluka | 05040 | |
| Fungizone Amphotericin B | Invitrogen-Gibco | 15290018 | |
| Trephine blades | Bausch and Lomb | T3096 | 6.00mm |
| O.C.T. Compound | Electron Microscopy Sciences | 62550-01 | 4583 |
| Sciences | |||
| Cryostat | Leica | CM1900 | |
| Vibratome | Leica | Series 1000 | |
| Confocal microscopy; | Carl Zeiss | LSM510 | |
| Anti-Synaptic Vesicle Protein 2 (SV2) mouse monoclonal antibody | DSHB | N/A | |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) polyclonal rabbit antibody | DAKO | DAKO | |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma | P4170 |
References
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