תרבות Organotypic של הרשתית מלא עובי למבוגרים חזירי
Summary
כאן אנו מתארים שיטה חסכונית לתרבות organotypic של הרשתית חזירי הבוגרת במשך שבעה ימים. בקצרה, נייר סינון סטרילי שימש להרים את הרשתית העצבית מן הרשתית ואת photoreceptor מקום על הצד להוסיף שהעלו לעמוד מחוייט.
Abstract
יש ביקוש מוכר במודלים חוץ גופית זה יכול להחליף או לצמצם את הניסויים בבעלי חיים. הרשתית חזירי יש מבנה עצבי דומה הרשתית האנושית ולכן הוא זן בעל ערך לחקר המנגנונים של פגיעה ברשתית האנושית מחלה ניוונית. כאן אנו מתארים שיטה חסכונית לתרבות organotypic של הרשתית חזירי מבוגר מבודד מעיני המתקבל מטבחיים. לאחר הסרת פלח קדמי, להב המקדחה נעשה שימוש כדי ליצור מספר רב של עצבי הרשתית, ברוך קרום הרשתית, דמית העין, בלובן העין של explants מן קטע האחורי של העיניים חזירי מבוגר. פיסת נייר סינון סטרילי שימש להרים את הרשתית העצבית מן explant כל אחד. המתחם מסנן נייר הרשתית היה מתורבת (צד photoreceptor ומעלה) על גבי להוסיף, שהתקיים הרחק בתחתית הצלחת לעמוד על ידי תרבות מחוייט. לעמוד מאפשרת זרימת טוב של המדיום תרבות על שני הצדדים של הרשתית. ככלל, הליך זה הוא פשוט, לשחזור, ומאפשרת שימור של מבנה הרשתית יליד לפחות שבעה ימים, מה שהופך אותו מודל שימושי עבור מגוון רחב של מחקרים מורפולוגיים, תרופתי, ו ביוכימי על הרשתית יונקים.
Protocol
Discussion
החוקרים Vision הקימו מגוון רחב של מערכות תרבות ברשתית, כולל מערכות organotypic, ללמוד מגוון רחב של נושאים, כגון תא גזע השתלת רשתית 1, התחדשות הרשתית 2, ביטוי גנים אקסוגניים 3-5. עם זאת, הרשתית יונקים בוגרים קשה לשמור במבחנה, בעיקר בשל אנרגיה גבוהה לדרישות phot…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענק EY 012,031 (ET-A), פרס קרן קירבי FM (ET-A), מחקר למניעה, עיוורון Inc (MAZ), ניו ג'רזי האריות Eye Research Foundation (MAZ), מכון עיניים של ניו ג'רזי (MAZ), את ג'יי ג'וזף מרגריט DiSepio רשתית מחקר קרן (MAZ), ואת מיטשל ג'ניס ואסאר ואשבי מיטשל Fellowship (AMK).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| MEM | Invitrogen-Gibco | 10370-021 | |
| 5 mL pipette tip | ISC BioExpress | P-3250-19 | |
| NUNC cell culture insert | Thermal | 137443 | 8μm, Polycarbonate |
| Whatman 4M Filter paper | Whatman | 1004 | |
| DMEM | Cellgro-mediatech Inc | 10-013-CV | |
| Agar | Fluka | 05040 | |
| Fungizone Amphotericin B | Invitrogen-Gibco | 15290018 | |
| Trephine blades | Bausch and Lomb | T3096 | 6.00mm |
| O.C.T. Compound | Electron Microscopy Sciences | 62550-01 | 4583 |
| Sciences | |||
| Cryostat | Leica | CM1900 | |
| Vibratome | Leica | Series 1000 | |
| Confocal microscopy; | Carl Zeiss | LSM510 | |
| Anti-Synaptic Vesicle Protein 2 (SV2) mouse monoclonal antibody | DSHB | N/A | |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) polyclonal rabbit antibody | DAKO | DAKO | |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma | P4170 |
References
- Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 3503-3512 (2008).
- Kretz, A., Marticke, J. K., Happold, C. J., Schmeer, C., Isenmann, S. A primary culture technique of adult retina for regeneration studies on adult CNS neurons. Nat Protoc. 2, 131-140 (2007).
- Donovan, S. L., Dyer, M. A. Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures. Nat Protoc. 1, 2710-2718 (2006).
- Koizumi, A., Zeck, G., Ben, Y., Masland, R. H., Jakobs, T. C. Organotypic culture of physiologically functional adult mammalian retinas. PLoS One. 2, e221-e221 (2007).
- Lye, M. H., Jakobs, T. C., Masland, R. H., Koizumi, A. Organotypic culture of adult rabbit retina. J Vis Exp. , (2007).
- Ames, A., Li, Y. Y., Heher, E. C., Kimble, C. R. Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na+ transport. J Neurosci. 12, 840-853 (1992).
- Kobuch, K. Maintenance of adult porcine retina and retinal pigment epithelium in perfusion culture: characterisation of an organotypic in vitro model. Exp Eye Res. 86, 661-668 (2008).
- Kaempf, S., Walter, P., Salz, A. K., Thumann, G. Novel organotypic culture model of adult mammalian neurosensory retina in co-culture with retinal pigment epithelium. J Neurosci Methods. 173, 47-58 (2008).
- Guduric-Fuchs, J. Immunohistochemical study of pig retinal development. Mol Vis. 15, 1915-1928 (2009).
- Chandler, M. J., Smith, P. J., Samuelson, D. A., MacKay, E. O. Photoreceptor density of the domestic pig retina. Vet Ophthalmol. 2, 179-184 (1999).
