Organotypische Cultuur van Full-dikte van volwassen varkens Retina
Summary
Hier beschrijven we een kosteneffectieve techniek voor organotypische cultuur van volwassen varkens netvlies gedurende zeven dagen. In het kort werd een steriel filtreerpapier wordt gebruikt om de neurale netvlies lift af van de RPE en plaats fotoreceptor kant naar boven op een insert opgevoed door een op maat gemaakte stand.
Abstract
Er is een erkende vraag naar in vitro modellen die kunnen vervangen of verminderen dierproeven. Varkens netvlies heeft een vergelijkbare neuronale structuur van de menselijke retina en is daarom een waardevolle soorten voor het bestuderen van de mechanismen van de menselijke netvlies letsel en degeneratieve ziekte. Hier beschrijven we een kosteneffectieve techniek voor organotypische cultuur van volwassen varkens geïsoleerd netvlies van de ogen verkregen uit een slachthuis. Na het verwijderen van het voorste segment, was een trephine mes gebruikt om meerdere neurale netvlies-Bruch's membraan-RPE-vaatvlies-sclera explantaten van het achterste segment van de volwassen varkens ogen te creëren. Een stuk steriel filtreerpapier werd gebruikt om de neurale netvlies lift off van elk explantatie. Het papieren filter-netvlies complex werd gekweekt (fotoreceptor kant naar boven), boven op een insert, die weg was gehouden van de bodem van de cultuur schotel door een op maat gemaakte stand. De stand zorgt voor een goede circulatie van het kweekmedium aan beide zijden van het netvlies. Het geheel genomen is deze procedure is eenvoudig, reproduceerbaar, en laat het behoud van inheemse netvlies structuur voor ten minste zeven dagen, waardoor het een bruikbaar model voor een verscheidenheid van morfologische, farmacologische en biochemische studies over zoogdieren netvlies.
Protocol
Discussion
Vision onderzoekers hebben een verscheidenheid van het netvlies cultuur, met inbegrip van organotypische systemen, om een verscheidenheid van onderwerpen, zoals het netvlies stamceltransplantatie 1, retinale regeneratie 2, en exogene genexpressie 3-5 te bestuderen. Echter, volwassen zoogdieren netvlies is moeilijk vol te houden in vitro, voornamelijk als gevolg van de hoge energie-eisen van de fotoreceptoren 6. Koizumi et al.. Beschreef een konijn netvlies or…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie EY 012.031 (ET-A), een prijs van de FM-Kirby Foundation (ET-A), Onderzoek om Blindheid, Inc (MAZ), The New Jersey Lions Eye Research Foundation (MAZ) Prevent, De Eye Institute van de New Jersey (MAZ), de Joseph J. en Marguerite DiSepio Retina Research Fund (MAZ), en de Janice Mitchell Vassar en Ashby Mitchell Fellowship (AMK).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| MEM | Invitrogen-Gibco | 10370-021 | |
| 5 mL pipette tip | ISC BioExpress | P-3250-19 | |
| NUNC cell culture insert | Thermal | 137443 | 8μm, Polycarbonate |
| Whatman 4M Filter paper | Whatman | 1004 | |
| DMEM | Cellgro-mediatech Inc | 10-013-CV | |
| Agar | Fluka | 05040 | |
| Fungizone Amphotericin B | Invitrogen-Gibco | 15290018 | |
| Trephine blades | Bausch and Lomb | T3096 | 6.00mm |
| O.C.T. Compound | Electron Microscopy Sciences | 62550-01 | 4583 |
| Sciences | |||
| Cryostat | Leica | CM1900 | |
| Vibratome | Leica | Series 1000 | |
| Confocal microscopy; | Carl Zeiss | LSM510 | |
| Anti-Synaptic Vesicle Protein 2 (SV2) mouse monoclonal antibody | DSHB | N/A | |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) polyclonal rabbit antibody | DAKO | DAKO | |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma | P4170 |
References
- Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 3503-3512 (2008).
- Kretz, A., Marticke, J. K., Happold, C. J., Schmeer, C., Isenmann, S. A primary culture technique of adult retina for regeneration studies on adult CNS neurons. Nat Protoc. 2, 131-140 (2007).
- Donovan, S. L., Dyer, M. A. Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures. Nat Protoc. 1, 2710-2718 (2006).
- Koizumi, A., Zeck, G., Ben, Y., Masland, R. H., Jakobs, T. C. Organotypic culture of physiologically functional adult mammalian retinas. PLoS One. 2, e221-e221 (2007).
- Lye, M. H., Jakobs, T. C., Masland, R. H., Koizumi, A. Organotypic culture of adult rabbit retina. J Vis Exp. , (2007).
- Ames, A., Li, Y. Y., Heher, E. C., Kimble, C. R. Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na+ transport. J Neurosci. 12, 840-853 (1992).
- Kobuch, K. Maintenance of adult porcine retina and retinal pigment epithelium in perfusion culture: characterisation of an organotypic in vitro model. Exp Eye Res. 86, 661-668 (2008).
- Kaempf, S., Walter, P., Salz, A. K., Thumann, G. Novel organotypic culture model of adult mammalian neurosensory retina in co-culture with retinal pigment epithelium. J Neurosci Methods. 173, 47-58 (2008).
- Guduric-Fuchs, J. Immunohistochemical study of pig retinal development. Mol Vis. 15, 1915-1928 (2009).
- Chandler, M. J., Smith, P. J., Samuelson, D. A., MacKay, E. O. Photoreceptor density of the domestic pig retina. Vet Ophthalmol. 2, 179-184 (1999).
