Cultura organotípicas de Full-espessura Retina Porcina Adulto
Summary
Aqui nós descrevemos uma técnica de custo-benefício para a cultura de retina organotípicas suína adulto por sete dias. Resumidamente, um papel estéril filtro foi utilizado para levantar a retina neural fora do RPE e do lado coloque fotorreceptoras em cima uma inserção levantadas por um carrinho feito por encomenda.
Abstract
Há uma demanda reconhecida por modelos in vitro que podem substituir ou reduzir a experimentação animal. Retina suína tem uma estrutura semelhante neuronal a retina humana e, portanto, uma espécie valiosa para estudar mecanismos de lesão da retina humana e doenças degenerativas. Aqui nós descrevemos uma técnica de custo-benefício para a cultura de retina organotípicas suína adulto isolado de olhos obtido a partir de um matadouro. Após a remoção do segmento anterior, uma lâmina de trépano foi usado para criar múltiplas retina neural-Bruch membrana-RPE-coróide esclera-explantes do segmento posterior de olhos de porco adulto. Um pedaço de papel filtro estéril foi utilizada para levantar a retina neural off de cada explante. O complexo de papel-filtro retina foi cultivado (lado fotorreceptor para cima) em cima de uma inserção, que foi realizada longe do fundo do prato de cultura por um carrinho feito por encomenda. O stand permite uma boa circulação do meio de cultura para ambos os lados da retina. Globalmente, este procedimento é simples, reprodutível e permite a preservação da estrutura da retina nativo para pelo menos sete dias, tornando-se um modelo útil para uma variedade de estudos morfológicos, farmacológicos e bioquímicos na retina de mamíferos.
Protocol
Discussion
Pesquisadores visão criaram uma variedade de sistemas de cultura da retina, incluindo sistemas de organotípicas, para estudar uma variedade de questões, tais como o transplante de células-tronco da retina 1, a regeneração da retina 2, e expressão de genes exógenos 3-5. No entanto, a retina de mamíferos adultos é difícil manter in vitro, principalmente devido à alta demanda de energia dos 6 fotorreceptores. Koizumi et al. Descrito um sistema de cul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder EY 012.031 (ET-A), um prêmio da Fundação FM Kirby (ET-A), para prevenir a cegueira Research, Inc. (MAZ), The New Jersey Lions Eye Research Foundation (MAZ), O Instituto Eye of New Jersey (MAZ), o J. Joseph e Marguerite Retina DiSepio Research Fund (MAZ), eo Vassar e Janice Mitchell Mitchell Ashby Clube (AMK).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| MEM | Invitrogen-Gibco | 10370-021 | |
| 5 mL pipette tip | ISC BioExpress | P-3250-19 | |
| NUNC cell culture insert | Thermal | 137443 | 8μm, Polycarbonate |
| Whatman 4M Filter paper | Whatman | 1004 | |
| DMEM | Cellgro-mediatech Inc | 10-013-CV | |
| Agar | Fluka | 05040 | |
| Fungizone Amphotericin B | Invitrogen-Gibco | 15290018 | |
| Trephine blades | Bausch and Lomb | T3096 | 6.00mm |
| O.C.T. Compound | Electron Microscopy Sciences | 62550-01 | 4583 |
| Sciences | |||
| Cryostat | Leica | CM1900 | |
| Vibratome | Leica | Series 1000 | |
| Confocal microscopy; | Carl Zeiss | LSM510 | |
| Anti-Synaptic Vesicle Protein 2 (SV2) mouse monoclonal antibody | DSHB | N/A | |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) polyclonal rabbit antibody | DAKO | DAKO | |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma | P4170 |
References
- Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 3503-3512 (2008).
- Kretz, A., Marticke, J. K., Happold, C. J., Schmeer, C., Isenmann, S. A primary culture technique of adult retina for regeneration studies on adult CNS neurons. Nat Protoc. 2, 131-140 (2007).
- Donovan, S. L., Dyer, M. A. Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures. Nat Protoc. 1, 2710-2718 (2006).
- Koizumi, A., Zeck, G., Ben, Y., Masland, R. H., Jakobs, T. C. Organotypic culture of physiologically functional adult mammalian retinas. PLoS One. 2, e221-e221 (2007).
- Lye, M. H., Jakobs, T. C., Masland, R. H., Koizumi, A. Organotypic culture of adult rabbit retina. J Vis Exp. , (2007).
- Ames, A., Li, Y. Y., Heher, E. C., Kimble, C. R. Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na+ transport. J Neurosci. 12, 840-853 (1992).
- Kobuch, K. Maintenance of adult porcine retina and retinal pigment epithelium in perfusion culture: characterisation of an organotypic in vitro model. Exp Eye Res. 86, 661-668 (2008).
- Kaempf, S., Walter, P., Salz, A. K., Thumann, G. Novel organotypic culture model of adult mammalian neurosensory retina in co-culture with retinal pigment epithelium. J Neurosci Methods. 173, 47-58 (2008).
- Guduric-Fuchs, J. Immunohistochemical study of pig retinal development. Mol Vis. 15, 1915-1928 (2009).
- Chandler, M. J., Smith, P. J., Samuelson, D. A., MacKay, E. O. Photoreceptor density of the domestic pig retina. Vet Ophthalmol. 2, 179-184 (1999).
