Organotypischen Kultur der Full-Dicke ausgewachsenen Schweinen Retina
Summary
Hier beschreiben wir eine kostengünstige Methode zur organotypischen Kultur von ausgewachsenen Schweinen Netzhaut für sieben Tage. Kurz gesagt, wurde ein steriles Filterpapier verwendet, um die neuronalen Netzhaut abheben von der RPE und Ort Photorezeptor Seite nach oben auf einem Einsatz von einem maßgeschneiderten Stand angehoben.
Abstract
Es ist ein anerkannter Bedarf an In-vitro-Modellen, zu ersetzen oder reduzieren kann Tierversuch. Porcine Netzhaut hat eine ähnliche neuronale Struktur der menschlichen Netzhaut und ist daher eine wertvolle Arten für das Studium Mechanismen der menschlichen Netzhaut Verletzungen und degenerativen Erkrankungen. Hier beschreiben wir eine kostengünstige Methode zur organotypischen Kultur von ausgewachsenen Schweinen Netzhaut vor Augen von einem Schlachthof erhalten isoliert. Nach dem Entfernen der vorderen Segment wurde ein Trepan Klinge verwendet, um mehrere neurale Retina-Bruch-Membran-RPE-Aderhaut-Sklera Explantate aus dem hinteren Bereich des ausgewachsenen Schweinen Augen zu schaffen. Ein Stück sterile Filterpapier wurde verwendet, um die neuronalen Netzhaut abhebt von jedem Explantat. Das Filterpapier-Retina-Komplex wurde kultiviert (Photorezeptor Seite nach oben) auf dem Gipfel eines Einsatzes, die vom Boden der Kulturschale mit einem maßgeschneiderten Stand gehalten wurde. Der Stand ermöglicht eine gute Zirkulation des Kulturmediums auf beiden Seiten der Netzhaut. Insgesamt ist dieses Verfahren einfach, reproduzierbar und erlaubt Erhaltung der einheimischen retinalen Struktur für mindestens sieben Tage, so dass es ein nützliches Modell für eine Vielzahl von morphologischen, pharmakologische und biochemische Untersuchungen an Säugetieren Netzhaut.
Protocol
Discussion
Vision-Forscher haben eine Vielzahl von Netzhaut-Kultur etabliert, darunter organotypischen Systeme, um eine Vielzahl von Themen, wie Retina Stammzelltransplantation 1, retinale Regeneration 2 und exogene Genexpression 3-5 studieren. Allerdings ist erwachsener Säugetiere Netzhaut schwer aufrecht zu erhalten in vitro, vor allem aufgrund der hohen Energiebedarf der Photorezeptoren 6. Koizumi et al. Beschrieben ein Kaninchen Netzhaut organotypischen Kultur, in …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom NIH EY 012031 (ET-A), eine Auszeichnung von der FM Kirby Foundation (ET-A), Forschung zur Erblindung, Inc. (MAZ), The New Jersey Lions Eye Research Foundation (MAZ) Prevent unterstützt, The Eye Institute of New Jersey (MAZ), die Joseph J. und Marguerite DiSepio Retina Research Fund (MAZ) und die Janice Mitchell Vassar und Ashby Mitchell Fellowship (AMK).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| MEM | Invitrogen-Gibco | 10370-021 | |
| 5 mL pipette tip | ISC BioExpress | P-3250-19 | |
| NUNC cell culture insert | Thermal | 137443 | 8μm, Polycarbonate |
| Whatman 4M Filter paper | Whatman | 1004 | |
| DMEM | Cellgro-mediatech Inc | 10-013-CV | |
| Agar | Fluka | 05040 | |
| Fungizone Amphotericin B | Invitrogen-Gibco | 15290018 | |
| Trephine blades | Bausch and Lomb | T3096 | 6.00mm |
| O.C.T. Compound | Electron Microscopy Sciences | 62550-01 | 4583 |
| Sciences | |||
| Cryostat | Leica | CM1900 | |
| Vibratome | Leica | Series 1000 | |
| Confocal microscopy; | Carl Zeiss | LSM510 | |
| Anti-Synaptic Vesicle Protein 2 (SV2) mouse monoclonal antibody | DSHB | N/A | |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) polyclonal rabbit antibody | DAKO | DAKO | |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma | P4170 |
References
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