Lipofilik boya birleştiren In situ Hibridizasyon, İmmünohistokimya ve Histoloji

1. Lipofilik Boya enjeksiyon Doku hazırlanması: Bütün doku diseksiyonlar ve manipülasyon uygun boyutta iğne ile peristaltik pompa kullanarak transcardial perfüzyon 0.1 M fosfat tamponu (pH 7.4),% 4 paraformaldehid (PFA) sabit hayvanlarda yapılmaktadır. 6 aya kadar Doku% 4 PFA buzdolabında saklanabilir. Tüm hazırlıklar ve manipülasyon görüntüleme için gliserol ile montaj kadar% 0.4 veya daha yüksek PFA yapılmaktadır. Bu miktar PFA RNases etkin bir şekilde ortadan kaldırır ve in situ hibridizasyon RNA korur. Boya Depolama: Tüm boyalar, ışığa duyarlı olarak, en aza indirmek için hava sirkülasyonu ve parlak gün ışığına maruz karanlık bir kapalı bölmeye saklanan olmalıdır. Çapraz kontaminasyonu engellemek için, ayrı bir enstrüman seti, her boya ele kullanılmalıdır. Öncelikle, boya için bir uygulama sitesi seçilen sitesi ve boya yerleştirme için erişim görsel olarak teyit etmek için seçilmiş ve gereksiz doku çıkarılan olmalıdır. Uygulama yeri seçimi bu süreçte en önemli adımdır. Göz altında nöronal nüfus etiketlemek için güzel bir site seçimi ve gereksiz yapılar değil zor olabilir. Diseksiyon kapsamında görsel kontrol altında belirli bir sistem içine yerleştirme doğruluğu söz konusu nöroanatomi anlayışı belli bir düzeyi gerektirir. Boya ya periferik veya santral projeksiyonları sırasıyla, belirli bir proje (yani beyin, periferik sinir, kulak, göz) için gerekli etiket, merkezi ya da periferik konabilir. Lipophic boyalar, verilen bir parça içine yansıtarak belirli bir nöron veya bütün nöronlar doldurarak, hem de retrograd ve anterogradely belirli bir nöron ait tüm işlemler karışacaktır. MTTI NeuroVue boya kolay uygulama için filtre şeritler üzerine önceden yüklenmiş olarak geliyor. Boya, aynı zamanda% 100 DMSO içinde çözünmüş (başlık altında çalışmak) ve bu çözüm batırılmış ince saç ve daha sonra küçük uygulamalar için kurutulmuş olabilir. Önceden yüklenmiş filtre kağıdı boya microscissors uygun büyüklükte üçgen parçalar halinde kesilir. Boya boyutu örnek etiketli olan yapı boyutu ve aynı anda kullanılabilir olan renklerin sayısını boyutuna bağlı olacaktır. Diğer yapılar etiketleme önlemek için mümkün olduğu kadar küçük bir parça kesmek için emin olun. Boya kağıt tamamen kuru hava, daha sonra herhangi bir boya kalıntısı kaldırmak, ya dab alkol aletleri tahrik işleme için kesme ve forseps microsissors kullandıktan sonra. Bu istenmeyen yapıların etiket araçların üzerinde kalan boya ile numune karışmasını önlemek içindir. Böyle bir beyin gibi yumuşak doku içine yerleştirilmesi için filtre doğrudan doku delmek için filtre üçgenin bir nokta kullanarak eklenebilir. Daha sert dokularda boya kolay takılmasını sağlayan bir kesi yapmak için. Bir diseksiyon iğnesi, doku içine filtre itmek için kullanmayın. Bu doku yanlış yerleşim ve aksamalara neden olabilir. NeuroVue boya gibi ek nöron popülasyonları etiketlenmesi için gerekli alternatif dalga boylarında yerleştirin. Boya, ekleme ve konumunu doğruladıktan sonra, örnekler% 4 PFA güvenli şekilde kapalı flakon yerleştirilir ve 36 inkübe ° C (başına yaklaşık 2 mm kapalı yaş ve difüzyon mesafesi bağlı olarak 2-14 gün karanlıkta gün 36 ° C). Epiflouresence A diseksiyon kapsamı boya istenilen yere yayılmış ve difüzyon yetersiz görülürse numune inkübatör geri konabilir değerlendirmek için kullanılabilir. Epifluorescene difüzyon algılamak için normal bir diseksiyon kapsamı kullanarak boya yayılmış olan gerçek uzunluğu hafife. Yayılan floresan kullanırken boya konsantrasyonu eşek kadar yüksek ise, görsel olarak emme su verme neden olabilir. Ilgi istenilen doku disseke ve gliserol ile bir slayt monte ve konfokal mikroskop ile görüntüleme dakika muamele bütün. Konfokal ayarları gibi 1, 2 açıklanmıştır. Doku boyutu bir slayt monte bütün engeller varsa, seri kesit (aşağıya bakın) ihtiyaç vardır. Doku hazırlanması, görüntüleme ve boya spektral özellikleri hakkında daha fazla bilgi mevcuttur : http://www.mtarget.com/mtti/documents/NeuroVuebrochuremar2010.pdf Şekil 1. Deney şematik bakış kulak, tüm yapılar görünüm için izin maruz kalmaktadır . Lipofilik boya enjekte edilir ve sonra diffüz izin verilir. Difüzyon sonra farklı nöron popülasyonları farklı boyalar etiketli görülebilir. Sonra, in situ hibridizasyon (Sox2) kulak ve etiketler mRNA yapılır. İmmünohistokimya sonra gerçekleştirilen(Myo7, tubulin) protein ekspresyonu görselleştirmek için. In situ hibridizasyon ve immünohistokimya görüntülenebilmekte hangi histolojik kesitlerde izledi. 2. Situ Hibridizasyon. (Lipofilik boyalar ile takibi mümkün olacak sonra) in situ hibridizasyon ile başlamak istiyorum durumda doku hazırlanması, Bölüm 1 bakınız. Her yıkama, belirtilmediği sürece, bir inverter / karıştırıcı oda sıcaklığında 2 mL solüsyon ile yapılır. Temiz, RNaz ortamda çalışmak için emin olun. Dehydrate ve daha sonra kademeli metanol dizi örnekleri rehidrate. % 100 1 saat geceleme @ 4 ° C (opsiyonel: -20 ° C'de% 100 metanol mağaza örnekleri) % 75 x 5 dk. @ 4 ° C % 50 x 5 dk. @ 4 ° C % 25 x 15 dk. @ 4 ° C (veya doku lavabolar kadar) 2 ml Eppendorf tüp (ücretsiz) RNaz örnekleri aktarın. PBS (1x PBS) üç kez yıkayın ve ileride kullanmak için (60 ° C) hibridizasyon fırın açmak. PBS x 5 dk. PBS x 5 dk. PBS x 5 dk. 2.0 ml taze PBS 20 mg / mL stok Proteinaz K (Ambion Kedi # AM2546) 2 mcL Digest doku. Gerçek PK sindirim süresi, embriyonun yaşına bağlıdır. Aşağıdaki kez kaba bir tahmin. Deproteination kritik bir adım olarak Sindirim yakından izlenmelidir. Aşırı-sindirim yapısal bütünlük kaybına neden olacaktır Under-sindirim kötü prob penetrasyon neden olacaktır. Sindirim iyi bir göstergesi, neredeyse temizlemek için opak doku bir değişiklik. Tablo 1. Fare doku proteinaz K sindirimi. YAŞ (embriyonik gün) ZAMAN (dakika) E8.5 6 E9.5 10 E10.5 13 E11.5 15 E12.5 17 E14.5 18 E16.5 + 20 + 5 dakika boyunca% 4 PFA örnekleri kuluçka sindirim durdurun. PBS içinde yıkayın. PBS x 1 dak. PBS x 5 dk. PBS x 5 dk. PBS x 5 dk. Mümkün olduğunca ortadan kaldırmak için özel dikkat PBS atın. Örnekleri Prehybridize: 60 inkübe ° C en az 1 saat için 1.8 mL hibridizasyon karışımı invertör. 85 ° C ileride kullanmak üzere IsoTemp ısıtma bloğu ayarlayın. Bir saat yaklaştıkça, 85 inkübasyon doğasını somon sperm DNA (Invitrogen Cat No: 15.632-011) ° C de 10 dakika. Kullanana kadar buz üzerinde ayarlayın. Prehybridization en az 1 saat sonra, 200 mcL denatüre ssDNA ve her örnek DIG etiketli Spastine Özgü Riboprop yaklaşık 100ng ekleyin. 60 ° C hibridizasyon fırında geceleme melezleşme. 2 mL 2X SSC ile hibridizasyon karışımı değiştirin. IsoTemp ısı blokları ayarlayın 37 ° C ve 70 ° C ileride kullanmak için. 2X SSC x 10 dakika ile yıkayınız. @ 60 ° C hibridizasyon fırın. 2X SSC x 10 dakika ile yıkayınız. @ 60 ° C hibridizasyon fırın. 2X SSC x 10 dakika ile yıkayınız. @ 60 ° C hibridizasyon fırın. 2X SSC x 60 dakika ile yıkayınız. @ 70 ° C IsoTemp ısı bloğu. 70 ° C, herhangi bir endojen alkalin fosfataz aktivitesini ortadan kaldırır. Bu belki de arka plan azaltılmasına yönelik en önemli adımdır. Bölümü (d) iki 30 dakika bölünmüş olabilir. doku hasarı en aza indirmek için yıkar. PBS x 5 dakika ile yıkayınız. RNaz ileride kullanmak üzere buz üzerinde bir enzim çözülme. PBS değiştirin ve RNaz bir Enzim 1.0 mcL (Fermentas EN0531 10 mg / ml) x 60 dk ekleyin. @ 37 ° C IsoTemp ısı bloğu (prob yüksek konsantrasyonlu ise 90 dakika. Kuluçka dönemi tercih edilir). PBS / RNaz bir atın ve 4 kez yıkayın. 1X yıkama solüsyonu x 10 dk. 1X yıkama solüsyonu x 10 dk. 1X yıkama solüsyonu x 10 dk. 1X yıkama solüsyonu x 60 dk. @ 70 ° C IsoTemp ısı bloğu. 1X Blok Tampon 1 saat süreyle inkübe edin. Şu anda blok tampon, 2.0 ml ve 1 mcL (1:2000) örnek başına Anti-digoxigenin antikor hazırlar. Kısaca ters çevirin ve 4 bekletin ° C kullanana kadar. , 1 saat atmak blok tampon sonra ve örnekler 2.0 mL ön emilir blok tamponu + antikor ekleyin. Gece inkübe edin. Blok çözüm atın. 1X yıkama tamponu ile yıkayın. 1X yıkama tamponu x 5 dk. 1X yıkama tamponu x 5 dk. 1X 1 saat x 5-6 değişiklikler yıkama tamponu. Gecede 1X yıkama tamponu ile yıkayın. 1X detectio ile durulayın.n tampon 10 dakika. Iyi plaka algılama tampon numune aktarın. Tamponu çıkarın ve BM Mor (Roche 11442074001) ile tespit istenen sinyal gücü elde edilinceye kadar (uzun problar ile bu gecede anlamına gelebilir). BM mor folyo veya bir kutu ile ışığa duyarlı kapak. Kullanmadan önce BM Mor karıştırın. Örnekleri, serbest dalgalı ve kuyulara sıkışmış değil emin olun. 1 saat sonra sinyal kontrol edin. Örnekleri kuyuları x 5 dakika içinde 1X algılama tamponu ile durulayın. Görüntü veya mağaza örnekleri 4% 4 PFA ° C. * Örnekler bu aşamada görüntülü ve / veya immünohistokimya adımdan sonra (Bölüm 3) eklenir olabilir. Çözümler: Nükleazlar ücretsiz su: 1 ml DEPC (Sigma) 1L steril ultra saf su ile karıştırın. Otoklav. 1X PBS: Mix 1 PBS 1L nükleaz ücretsiz su ve filtre paketi (Sigma) sterilize edin. 1X Yıkama çözüm: Mix 450 ml nükleaz ücretsiz su + 50 ml 10x yıkama solüsyonu ve filtre sterilize. Hibridizasyon Mix:% 50 Formamid hacmi (25 ml); hacimce% 50 2X SSC (25 ml), kütlece% 6 dekstran sülfat (3g). 1X Algılama Tampon: Mix 50 ml 10X algılama tampon 450 mL nükleaz ücretsiz su ve filtre ile sterilize edin. 1X Buffer Blok: 5 ml 10X Maleik Asit Buffer (Roche tampon seti), 40 ml nükleaz ücretsiz su, 5 ml 10X Blok Tampon. 2X SSC: Mix 50 ml 20X SSC 450 mL nükleaz ücretsiz su ve filtre ile sterilize edin. Kademeli metanol: nükleaz% 75 ücretsiz su,% 50 ve% konsantrasyonları 25 ile% 100 metanol seyreltilir. 3. İmmünohistokimya Adım 1 ve 2 Bölüm 2 tamamlanmış ise atlanabilir. Bu durumda, gliserol veya diğer montaj orta yıkanıp olduğundan emin olun. Tüm antikorlar hala proteinaz K sindirimi sonra epitop algılamak için mümkün olacağını unutmayın. (Bkz. Tablo 2) kendi özgünlüklerini korumak memeli dokusunda in situ hibridizasyon ile birlikte kullanılabilir antikorların kısa bir liste var. Lipofilik boyalarla doku kurtulmak için (Bölüm 2 yılında yürürlüğe tamamlanmış değilse) Kademeli etanol serisi:..% 50 etanol 5min,% 70 etanol 5 dakika,% 95-100 etanol bir gecede ya da istenen etkiyi,% 70 etanol 5 kadar dk,% 50 etanol 5min. Aşamalı olarak 5-10 dakika PBS ekleyerek rehidrate. 1 saat süreyle% 2.5 normal keçi serumu (NGS) ve çalkalayıcı üzerinde% 0.5 Triton X-100 @ RT doku engelleyin. (01:01 5% NGS:% 1.0, 1x PBS TritonX-100) Çalkalayıcı üzerinde 48-72 saat 4 ° C blok çözüm seyreltilmiş primer antikor (ler) ile inkübe edin. 1hr x 3 değişiklikleri için PBS ile yıkayın. 3. adımı olarak engelleyin. 12-24 saat için blok çözüm seyreltilmiş ikincil antikor (ler) ile inkübe @ 4 ° C çalkalayıcı (Invitrogen Alexa Fluor ® boyalar kullanıldı). 5. adımda gibi yıkayın. (Seçenek:. Sayacı ile leke leke ilk yıkamada 1 saat ile 10 mg / ml stok 1:2000 PBS içinde izleyin sulandırmak Hoechst nükleer PBS x 2-3 değişiklikleri @ RT çalkalayıcı üzerinde de yıkar) Görüntüleme: Örnekler tercihen eklendi çözümü için bir konfokal görüntüleme sistemi kullanarak, iletim ve epifluorescent mikroskobu ile bu adımı imaged olabilir. Bunu yapmak için ayırıcılar olarak lamelleri kullanarak gliserol tüm montaj kulakları rutin doku sıkıştırma üzerinden önlemek için. Tüm bu bağlama görüntüleme yerine ek veya epoksi reçine, örnekler gömülü olması ve eklenen histolojik detaylar için seri kesitli. Kombine tüm mount / bölüm analizi yararlanmak için, floresan sinyal konfokal görüntüleme adım beyazlatma kaçının. Çözümler Etanol çözümler:% 50 ve% 70 final konsantrasyonda distile su içinde seyreltilir% 100 etanol. Blok Çözüm: 01:01 seyreltme% 5 NGS:% 1.0 1x PBS (son çalışma dağılımı:% 2.5 NGS;% 0.5 'TritonX-100) TritonX-100. 1X PBS: 1L distile su karıştırın 1 PBS paketi (Sigma). % 5 NGS: Çözülme 2.5 mL NGS ve 47.5 ml 1x PBS ile karıştırın. 4 ° C saklayınız % 1.0 TritonX-100: Mix 49.5 ml 1x PBS ile 0.5 mL TritonX-100 (1 saat karıştırmak için Shaker @ RT terk). 4 ° C saklayınız Hoechst leke stok solüsyonu: 1x PBS mililitrede 10 mg Hoechst boyası çözülür. Tablo 2. Proteinaz K sindirilir doku ile çalışmak Antikorlar. Kedi # Madde Işportacı 25-6790 Anti-Myosin-VIIA Poliklonal Proteus Biosciences 25-6791 Anti-Myosin-VI Poliklonal Proteus Biosciences 9661 Cleaved Kaspaz-3 Poliklonal Hücre Sinyalizasyonu T7451 Anti-Asetillendirilmiş tubulin Monoclonal Sigma SORUN-238C Poliklonal Prox1 Covance 4. Histoloji Histoloji juvenil beyinleri ya da 2 veya 3 Parça tamamlanmasından sonra kalın bütün bağlar izleme lipofilik boya çözünürlüğü artırmak için Bölüm 1 sonra sokulabilir. Seri beyin bölümler için tek tip kesit kalınlığı elde etmek için Compresstome VF-700 mikrotom (Precisionary Instruments Inc, Greenville, Kuzey Carolina) önermektedir. Frozen kesit süreci 3 sırasında daha fazla boya sızıntısı nedeniyle daha az optimum olan . Bütün bağlar veya yüzey bağlar ilgi doku bölgelerin yeterli görselleştirme izin vermez seri bölümlerinin hazırlanması ve gliserol 4 montaj doku hazırlanması tercih edilen yöntemdir. Doku daha sonra epoksi reçine de gömülü ve TEM için cam veya elmas bıçak kullanarak 1-2 mikron kalınlığında kesilmiş olabilir. Alkol ve epoksi reçine içinde çözülür bu tekniği kullanarak en immünofloresan kalır ve plastik gömme sonra daha istikrarlı olacaktır, ancak, tüm lipofilik izleme bu aşamada tamamen kaybetmiş olacak. Gömülü kadar örnekleri ışığa duyarlı olacak gibi çekin. Compresstome VF-700 mikrotom kesit için Precisionary Instruments Inc önerileri izleyin Epoksi gömülmesi / Kesit: Fiksasyon: 0.1M fosfat tamponu gecede 1hr% 2.5 gluteraldehid / 1% PFA (pH 7.4). % 30 etanol (5min.),% 50 etanol (5min.),% 70 etanol (bir gecede 5min.),% 95 etanol (5x 10dk.), Ve mutlak etanol (5x 10dk: cam bir örnek şişesine dihidrat doku her biri). Solvent geçişi: 1:1 mutlak etanol: 5 dakika boyunca propilen oksit (PO). Solvent: PO sadece 5x 10dk. her biri. Reçine ile Sızma: 01:01 PO: çalkalayıcı üzerinde reçine gecede. Örnek ile çözüm (ler) düz gömme kalıbın içine dökün ve PO buharlaşmasına karşı 4-6 saat bekletin. Alternatif olarak, flakon kapağı çıkarın ve 4 saat (büyük doku ile çalışır) çalkalayıcı bırakmaktır. 4 saat için% 100 reçine örnekleri aktarın. Etiketi ile nihai kalıp reçine gömün. 60 ° C'de 24-48 saat süreyle inkübe polimerize. Gereksiz reçine en aza indirmek için gerekli bir jilet ile blok Kes. Ultramicrotome (bir Ultracut E Reichert-Jung) 1-2 um seri kesitler. Mount ve epifluorescent mikroskopi kullanılarak görüntü. İsteğe bağlı: histolojik lekeleri bölümlerin bir kısmı (yani Stevenel mavi) Leke istenirse (immünfloresans bu bölümlerde sürekli olmayacaktır fark). Çözümler Etanol çözümler:% 100 etanol,% 30,% 50,% 70 ve% 95 konsantrasyonları distile su ile seyreltilir. Fiksasyon çözüm: Mix 2.5 mL% 50 gluteraldehid, 5 ml% 10 Paraformaldehit ve 42.5 ml 0.1M fosfat tamponu pH 7.4 (son konsantrasyonları:% 2.5 gluteraldehid;% 4 PFA). 4 ° C saklayınız Epoksi Reçine: Poly / Yatak 812 Gömme Media/DMP-30 Kiti (Polysciences, Inc. # 08.792-1) ile birlikte verilen talimatlara göre yapın. -20 ° C'de muhafaza 5. Temsilcisi Sonuçlar Şekil 2. Lipofilik boya bir fare embriyo yerleştirilmesi ve görüntüleme Üç farklı dalga boyu lipofilik boyalarla enjekte edilir ve trigeminal sinirin (TN), glossofaringeal sinir (GN) ve vagus siniri (VN) merkezi projeksiyonları görselleştirme izin inkübe edildi. A), üç kraniyal sinirlerin periferik parçaya Lipofilik boya yerleşim merkezi süreçlerin görünüm için beyin difüzyon izin verecek. NeurVue Maroon ve VN: NeuroVue Jade TN NeuroVue Kırmızı, GN ile etiketlenir. B) (A) sonra kuluçka gibi aynı fare. Bazı difüzyon aydınlık mikroskobu ile görülebilir. C) aynı fare gibi (A ve B). Beyin disseke ve düz olarak monte edilmiştir. Etiketli üç sinirlerin merkezi süreçlerinin bazı etiketleme aydınlık mikroskobu ile görülebilir. (C) D) Konfokal görüntü. Konfokal özel nöronların görülebileceği ve diğerleri ile ilgili olarak her nüfus dağılımının değerlendirilmesi için üç farklı boyaların kullanımı sağlar. Boyalar sırayla görüntülenmiştir. NeuroVue Jade, 488 nm ve 500-550 nm emisyon uyarma görüntülendi. NeuroVue Kırmızı 550-600 nm, 535 nm ve emisyon bir uyarım görüntülendi. 643 nm ve 650-700 nm dalga boyunda emisyon uyarma NeuroVue Maroon görüntülendi. Şekil 3 deney şematik bir bakış . Kulak, tüm yapılar görselleştirme için izin maruz kalmaktadır. Lipofilik boyaenjekte edilir ve sonra diffüz izin. Difüzyon sonra farklı nöron popülasyonları farklı boyalar etiketli görülebilir. Sonra, in situ hibridizasyon (sox2) kulak ve etiketler mRNA yapılır. İmmünohistokimya sonra protein ekspresyonu (Myo7, tubulin) görselleştirmek için yapılmaktadır. In situ hibridizasyon ve immünohistokimya görüntülenebilmekte hangi histolojik kesitlerde izledi.