親油性色素を組み合わせることで、その場でハイブリダイゼーション、免疫組織化学、および組織学

1。親油性染料注入組織の準備： すべての組織の解剖と操作は適切なサイズの針で蠕動ポンプを使用してtranscardial灌流0.1 Mリン酸緩衝液（pH7.4）で4％パラホルムアルデヒド（PFA）で修正された動物で実施されています。組織は、6ヵ月まで冷蔵庫で4％PFAに格納することができます。すべての準備と操作はイメージングのためのグリセロールでマウントするまで、0.4％以上PFAで実施されています。 PFAのこの量は、実質的にRNaseを除去し、in situハイブリダイゼーション用RNAを保持します。 染料ストレージ： 彼らは感光性なので、すべての染料は、空気の循環と明るい日光への曝露を最小限に抑えるために暗い閉鎖区画に保管してください。クロスコンタミネーションを避けるために、楽器の別々のセットは、それぞれの色素を処理するために使用する必要があります。 最初に、染料のためのアプリケーションのサイトは、視覚的に選択されたサイト、および染料の配置のためのアクセスを確認するために選ばれ、余分な組織では、抽出する必要があります。アプリケーションのサイトを選択すると、このプロセスで最も重要なステップです。検討中のニ​​ューロンの人口にラベルを付けるために良いサイトを選択していない余分な構造は、挑戦することができます。解剖スコープの観察下で与えられた管への配置の精度は、問題の神経解剖学の理解の一定レベルが必要です。染料は、いずれの特定のプロジェクト（すなわち、脳、末梢神経、耳、目）のために、必要に応じて、それぞれの周辺や中央の突起を標識するために集中的にまたは末梢配置することができます。 Lipophic染料は、特定のニューロンまたは指定されたトラックに突出するすべてのニューロンを埋め、両方の逆行と順行性に、特定のニューロンに属するすべてのプロセスに拡散する。 MTTIからNeuroVue染料は、容易なアプリケーションのためのフィルタのストリップに事前ロードされています。染料はまた、100％DMSOに溶解することができます（フードの下で働く）と細い毛がこの溶液に浸漬し、その後、小規模なアプリケーションのために乾燥させることができる。プリロードされたろ紙の染料は、microscissorsと適切な大きさの三角形の小片に切断される。染料の大きさは試料、レッテルを貼られる構造体のサイズ、および同時に使用される色の数の大きさに依存します。他の構造をラベリング避けるために、可能な限り作品のような小さなカットしてください。染料は紙で完全に空気が乾燥し、任意の染料残留物を除去、または軽くするためにアルコールで器具を撹拌処理するためのカッティングと鉗子のためmicrosissorsを使用した後。これにより、不要な構造にラベルを付けることができる楽器に残留色素で試料を汚染しないようにすることです。 脳などの軟組織への挿入のためにフィルターを直接貫く組織へのフィルタ三角形のポイントを使用して挿入することができます。より厳格な組織では、色素を簡単に挿入できるように切開を作るために。組織にフィルタをプッシュする解剖針を使用しないでください。これは、組織の不正確な配置と混乱を引き起こす可能性があります。追加の神経集団のラベリングに必要に応じてNeuroVue染料の代替波長を挿入します。 染料を挿入し、その位置を確認した後、標本は4％PFAでしっかりと閉じてバイアルに配置され、36℃でインキュベート（あたり約2mmカバーする年齢と拡散距離に応じて2から14日間暗所でC 36の日° C）。 epiflouresenceと解剖スコープは、染料が目的の場所に拡散しており、拡散が不十分であると判断されている場合、試料がバックインキュベーターに置くことができるかどうかを評価するために使用することができます。拡散を検出するためにepifluoresceneなく、通常の解剖範囲を使用すると、色素が拡散している真の長さを過小評価される。色素濃度がロバに十分に高い場合が発する蛍光を使用するときにも、視覚的にそれは吸収の消光を引き起こす可能性があります。 興味の所望の組織が出切開し、全体としては、グリセロールとのスライドにマウントし、共焦点顕微鏡でイメージングに封入されています。共焦点の設定は、1、2に記載されている。組織のサイズがスライドにマウント全体を阻害する場合、シリアルセクショニングは、（下記参照）必要です。イメージングと色素のスペクトル特性のための組織の準備の詳細については下記にてご覧いただけます。 http://www.mtarget.com/mtti/documents/NeuroVuebrochuremar2010.pdf 図1。実験の回路図の概要。耳がすべての構造の可視化を可能にするために公開されています。親油性染料は、注入され、拡散されている。拡散後の異なる神経集団が異なる色素で標識された見ることができます。次に、in situハイブリダイゼーション （Sox2の）耳とラベルmRNA発現に実行されます。免疫組織化学は、その後に実施され（Myo7、チューブリン）タンパク質の発現を可視化する。 in situハイブリダイゼーションと免疫組織化学の両方を可視化できる組織切片が続きます。 （2）in situハイブリダイゼーションの あなたが（親油性色素を使用してトレースすることは不可能になったあとの）in situハイブリダイゼーションで開始したい場合には、第1部で組織の準備を参照してください。各洗浄は、特に断らない限り、インバータ/ミキサー上、室温で溶液2mLを用いて実施される。きれいな、RNaseフリー環境で動作するようにしてください。 脱水してから、段階的なメタノールの一連のサンプルを再水和する。 〜100％1時間一晩@ 4℃（オプション：100％メタノールで-20℃で保存サンプル） 75％× 5分。 @ 4℃ 50％× 5分。 @ 4℃ 25％× 15分。 @ 4 ° C（または組織のシンクまで） 2 mLのエッペンドルフチュー​​ブ（RNaseフリー）にサンプルを移す。 PBS（1X PBS）で3回洗浄し、将来の使用（60 ° C）のためのハイブリダイゼーションオーブンを回し。 PBS × 5分。 PBS × 5分。 PBS × 5分。 2.0mLの新鮮なPBS中/ 20mgを株式プロテイナーゼK（Ambion社の猫＃AM2546）2μLとダイジェスト組織。 実際のPKの消化時間は、胚の年齢に依存する。以下は、時間の概算です。除タンパクが重要なステップであるとして消化を注意深く監視する必要があります。過剰消化が構造的な整合性が失われますしながら下の消化が悪いプローブの浸透になります。消化の良い指標は、ほとんど透明に不透明から組織の変化である。 表1。プロテイナーゼK消化マウス組織での時間。 AGE（胚日） 時間（分） E8.5 6 E9.5 10 E10.5 13 E11.5 15 E12.5 17 E14.5 18 E16.5 + 20 + 5分間4％PFAでサンプルをインキュベートすることにより、消化を停止します。 PBSで洗浄する。 PBS × 1分。 PBS × 5分。 PBS × 5分。 PBS × 5分。 PBSは、可能な限り排除するために特別な注意を払って捨てる。 サンプルをプレハイブリダイゼーション：60℃でインキュベート少なくとも1時間1.8 mLのハイブリダイゼーションミックスのインバータでC。 〜85 ° C今後の使用のためにIsoTempのヒートブロックを設定します。 一時間が近づくにつれ、85℃インキュベーションによって変性サケ精子DNA（Invitrogen社カタログ番号15632〜011）℃で10分間。使用するまで氷上に設定する。 プレハイブリダイゼーションの少なくとも1時間後、200μLの変性のssDNAと各サンプルのDIG -標識リボプローブの約100ngを追加します。 60℃のハイブリダイゼーションオーブンで一晩ハイブリダイズする。 2 mLの2 × SSCのハイブリダイゼーションミックスを交換してください。将来の使用のため° Cと70 ° Cで37 IsoTempのヒートブロックを設定します。 2X SSC × 10分で洗浄する。 @ 60 ° Cのハイブリダイゼーションオーブンインチ 2X SSC × 10分で洗浄する。 @ 60 ° Cのハイブリダイゼーションオーブンインチ 2X SSC × 10分で洗浄する。 @ 60 ° Cのハイブリダイゼーションオーブンインチ 2X SSC × 60分で洗浄する。 @ 70 ° C IsoTempのヒートブロックインチ 70 ° Cは、内在性のアルカリホスファターゼ活性を削除します。これはおそらくバックグラウンドを減らすことに向けて最も重要なステップです。部分（d）は2つの30分に分割することができます。組織への損傷を最小限に抑えるために洗浄する。 PBS × 5分で洗浄する。 RNaseを将来使用するために氷上で酵素を解凍。 PBSを交換し、リボヌクレアーゼ酵素（Fermentas EN0531 10mgの/ mL）を× 60分の1.0μLを加える。 ° C IsoTempのヒートブロックで（プローブが高度に集中している場合90分。潜伏期間が優先される）@ 37。 PBS / RNaseを破棄し、4回洗浄する。 1Xの洗浄液× 10分。 1Xの洗浄液× 10分。 1Xの洗浄液× 10分。 1Xの洗浄液× 60分。 @ 70 ° C IsoTempのヒートブロックインチ 1時間1Xブロックバッファーでインキュベートする。 この時点では、ブロックバッファの2.0 mLを、1サンプルあたり1μL（1:2000）、抗ジゴキシゲニン抗体を準備。簡単に反転し、4℃で放置° Cを使用するまで。 1時間廃棄のブロックバッファの後、2.0 mLのプレ吸着ブロックのバッファを追加する+サンプルに対する抗体。 一晩インキュベートする。 ブロックのソリューションを捨てる。 1X洗浄バッファーで洗浄する。 1X洗浄バッファー× 5分。 1X洗浄バッファー× 5分。 1時間X 5月6日変更のための1 ×洗浄バッファー。 一晩1X洗浄バッファーで洗浄する。 1X detectioで洗い流してください10分間、n個のバッファ。 ウェルプレートに検出バッファーでサンプルを転送します。 バッファを削除し、目的の信号強度が（長いプローブで、これは一晩意味するかもしれない）が得られるまでBMパープル（ロシュ11442074001）で検出する。 BMパープルは、箔またはボックスのある光に敏感なカバーです。 使用前によくBMパープルを混ぜる。 サンプルはフリーフローティングのウェルに停止していないことを確認してください。 1時間後の信号を確認してください。 井戸× 5分で1X検出バッファーでサンプルを洗浄します。 4の4％PFA℃で画像またはストアサンプル *サンプルはおよび/または免疫組織化学工程の後、この段階で画像化することができます（下記の第3部）が追加されます。 ソリューション： ヌクレアーゼフリー水：1L滅菌超純水とミックス1 mLのDEPC（シグマ）。オートクレーブ。 1X PBS：1Lヌクレアーゼフリー水でミックス1 PBSのパケット（シグマ）と滅菌フィルター。 1X洗浄溶液：ミックス450mlをヌクレアーゼフリーの水+ 50mLの10倍の洗浄溶液および滅菌フィルター。 ハイブリダイゼーションミックス：50体積％ホルムアミド（25 mL）に、体積が50％2X SSC（25mL）中、6％デキストラン硫酸の質量（3G）による。 1X検出バッファー：450 mLのヌクレアーゼフリー水と滅菌フィルタとミックス50 mLの10倍検出バッファ。 1Xのブロックバッファ：5 mLの10Xマレイン酸バッファー（ロシュバッファのセット）、40 mLのヌクレアーゼフリーの水、5 mLの10Xブロックバッファー。 2X SSC：ミックス50 mLの20X SSCは、450 mLのヌクレアーゼフリーの水とフィルターで滅菌する。 傾斜メタノール：75％、50％、および25％濃度にヌクレアーゼフリー水で希釈し、100％メタノール。 3。免疫組織化学パート2が完了した場合は、手順1と2は省略することができます。その場合は、すべてのグリセロールまたは他の封入剤が洗い流されていることを確認してください。すべての抗体がまだプロテイナーゼK消化後にそれらのエピトープを検出することができるようになることに注意してください。我々は、彼らが（表2参照）、その特異性を保持するように哺乳動物の組織でin situハイブリダイゼーションと組み合わせて使用することができる抗体の短いリストを持っている。 50パーセントエタノール5分を、70％エタノール5分、夜間または必要に応じて95〜100％エタノールは、所望の効果まで、70％エタノール5：。。（第2部では効果に完了していない場合）親油性色素の組織を取り除くために段階的エタノールシリーズ分、50％エタノール5分。 段階的に5〜10分にPBSを添加することにより水和。 シェーカーに2.5％正常ヤギ血清（NGS）及び0.5％トリトンX – 100 @ RTで1時間ブロックの組織。 （1:1 5％NGS：1.0％TritonX – 100 1X PBSで） ブロックのソリューションシェーカー上で48〜72時間は@ 4 ° Cで希釈した一次抗体（s）でインキュベートする。 1時間× 3変化のためにPBSで洗浄する。 ステップ3のようにブロックします。 12 – 24のブロックの溶液中に希釈した二次抗体（S）シェーカー上で@ 4 ° C（Invitrogen社からのAlexa Fluor ®色素を使用した）でインキュベートする。 手順5のように洗浄する。 （オプション：。。最初の洗浄は、PBSで10mgの/ mlストック1:2000希釈としてカウンタは染色ヘキスト核で染色される1時間とフォローがシェーカー上でPBS X 2月3日変更@ RTでの洗浄） イメージング：試験片が優先的に追加された解決のために共焦点イメージングシステムを用いて、伝送と落射蛍光顕微鏡法の両方でこのステップでイメージングすることができます。これを行うために、我々は日常的にスペーサーとしてカバーグラスを使用してグリセロールの全体マウント金具は、組織の圧縮にわたって避けるために。この全体のマウントの画像の代わりに加えてまたはで、標本は組織学的詳細を追加するためのエポキシ樹脂に包埋して連続的に区分することができます。組み合わせた全体のマウント/セクション分析から利益を得るために、共焦点イメージングのステップで蛍光シグナルを漂白は避けてください。 ソリューションエタノール溶液：50％、70％の最終濃度まで蒸留水で希釈して100％エタノール。 ブロックソリューション：1:1希釈5％NGS：1.0％1X PBSでTritonX – 100（最終使用濃度：2.5％NGS、0.5％TritonX – 100）。 1X PBS：1Lの蒸留水にミックス1 PBSパケット（シグマ）。 5％NGS：融解2.5mlのNGSおよび47.5 mlの1X PBSでミックス。 4℃で保存します。 1.0％TritonX – 100：0.5mLのTritonX – 100でミックス49.5 mlの1X PBS（1時間混合することシェーカー@ RTのまま）。 4℃で保存します。 ヘキスト染色原液：1 × PBSのミリリットル当たり10mgのHoechst色素を溶かす。 表2。プロテイナーゼK消化組織と連携する抗体。 猫＃ アイテム ベンダー 25から6790 抗ミオシン- VIIAポリクローナルプロテウスサイエンス 25から6791 抗ミオシン- VIポリクローナルプロテウスサイエンス 9661 切断されたカスパーゼ-3ポリクローナル細胞シグナリング T7451 抗アセチル化チューブリンのMonoclonらシグマ PRB – 238C ポリクローナルProx1 Covance 4。組織学組織学は、若年性の脳のようなまたは部品2または3の完了後に厚い全体マウントでのトレースを親油性色素の解像度を増やすためにパート1の後に導入することができる。シリアル脳切片のために我々は、均一な切片厚を得るためにCompresstome VF – 700ミクロトーム（Precisionaryインスツルメンツ（株）、グリーンビル、ノースカロライナ州）をお勧めします。凍結切片は、原因切削プロセスは3の間大きな色素の漏れが少なく、最適です。全部マウントまたは表面のマウントが関心の組織領域の適切な可視化を許可しないときに連続切片の調製とグリセロール4に取り付けは、組織調製の好ましい方法です。組織はまた、その後、エポキシ樹脂に埋め込まれ、TEM用ガラスやダイヤモンドナイフを使用して1〜2μmの厚さで切断することができます。彼らはアルコールとエポキシ樹脂に溶解するようにこのテクニックを使用する場合、ほとんどの免疫が残っているとプラスチック製の包埋した後、さらに安定しているだろう、しかし、すべての親油性のトレースは完全にこの段階で失われます。それらが埋め込まれるまでのサンプルは光に敏感になるので予防策を取る。 Compresstome VF – 700ミクロトーム切片の場合は、Precisionaryインスツルメンツ社の推奨事項に従ってください。 エポキシ埋め込み/セクショニング： 固定：一晩に1時間0.1Mリン酸緩衝液（pH7.4）中2.5％グルタルアルデヒド/ 1％PFA。 30％エタノール（5分）、50％エタノール（5分）、70％エタノール（一晩に5分）、95％エタノール（5 × 10分ごと。）、および無水エタノール（5 × 10分：ガラス製サンプルバイアルの脱水の組織で各）。 溶剤暫定：1:1無水エタノール：5分間のプロピレンオキサイド（PO）。 溶剤：POのみ5X 10分。それぞれ。 樹脂との浸潤： 1：01 PO：シェーカー上で一晩樹脂。 フラット埋め込み金型に試料と解決策（複数可）を注ぎ、POを蒸発させるために、カウンタ4から6時間に残す。また、バイアルのキャップを外し、4時間（大規模な組織でうまく機能する）のためにシェーカーに残す。 4時間の100％の樹脂に試料を移す。 ラベルと、最終的な金型に樹脂で埋め込む。 24〜48時間、60℃でインキュベートすることによって重合する。 余分な樹脂を最小限に抑えるために、必要に応じてカミソリの刃を持つブロックをカット。ウルトラミクロトーム（Ultracut Eライヘルト大中が使用された）に1〜2ミクロン切片を切る。マウントと落射蛍光顕微鏡法を使用してイメージ。 オプション：必要に応じて（免疫蛍光は、これらのセクションでは持続されません実現する）組織学的染色（すなわちStevenelの青）を持つセクションの部分を染色する。 ソリューションエタノール溶液：30％、50％、70％、95％の濃度まで蒸留水で希釈して100％エタノール。 固定液：ミックス2.5mLの50％グルタルアルデヒド、5mLの10％のパラホルムアルデヒド、と42.5 mLの0.1Mリン酸バッファー、pH7.4（最終濃度：2.5％グルタルアルデヒド、4％PFA）。 4℃で保存します。 エポキシ樹脂：ポリ/ベッド812埋め込みMedia/DMP-30キット（Polysciences、株式会社＃08792から1）に付属の説明書にしたがってください。 -20℃で保存 5。代表的な結果 図2。マウス胚における脂溶性色素の配置とイメージング。つの異なる波長親油性色素を注入し、三叉神経（TN）、舌咽神経（GN）、および迷走神経（VN）の中央突起の可視化を可能にするためにインキュベートした。 A）その中心のプロセスの可視化のために脳幹への拡散を可能にする3つの脳神経の末梢部分に親油性色素の配置は。 NeurVueのマルーン、およびVN：：NeuroVue翡翠TNはNeuroVueレッド、GNで標識されている。インキュベーション後のようにB）と同じマウス（）。いくつかの拡散は、明視野顕微鏡で見ることができます。 C）と同じマウスのように（とB）。後脳を解剖し、フラットマウントされています。というラベルの3個の神経の中心のプロセスの一部ラベリングは明視野顕微鏡で見ることができます。 （C）のD）共焦点画像。共焦点特定の神経細胞の使用と見られる、と3種類の染料の使用は、他人との関係で各母集団の分布の評価を可能にすることができます。染料は順次撮像した。 NeuroVue翡翠は、488 nmおよび発光500〜550 nmの励起で画像化した。 NeuroVueレッドは、535 nmおよび発光550〜600 nmの励起で画像化した。 NeuroVueのマルーンは、643 nmおよび650から700 nmでの発光の励起で画像化した。 図3実験の回路図の概要。耳はすべての構造の可視化を可能にするために公開されています。親油性染料は、その後、注入と拡散することができました。拡散後の異なる神経集団が異なる色素で標識された見ることができます。次に、in situハイブリダイゼーション （Sox2の）耳とラベルmRNA発現に実行されます。免疫組織化学は、タンパク質の発現を可視化する（Myo7、チューブリン）が行われる。 in situハイブリダイゼーションと免疫組織化学の両方を可視化できる組織切片が続きます。