La combinazione di coloranti lipofili, In situ Ibridazione, Immunoistochimica e Istologia

1. Lipofili iniezione Dye Preparazione del tessuto: Tutte le dissezioni dei tessuti e le manipolazioni sono effettuati su animali fissate in 4% paraformaldeide (PFA) in tampone fosfato 0,1 M (pH 7,4) da perfusione transcardial utilizzando pompe peristaltiche con aghi di dimensioni appropriate. Tessuti possono essere memorizzati in 4% PFA in frigorifero per un massimo di 6 mesi. Tutti i preparati e le manipolazioni sono condotte nello 0,4% o superiore PFA fino montaggio con glicerolo per l'imaging. Questa quantità di PFA elimina efficacemente RNasi e preserva l'RNA per l'ibridazione in situ. Dye di stoccaggio: Tutti i coloranti devono essere conservate in un vano chiuso scuro per ridurre al minimo la circolazione dell'aria e l'esposizione a luce diurna, in quanto sono fotosensibili. Per evitare la contaminazione crociata, un gruppo separato di strumenti devono essere utilizzati per gestire ogni colorante. In primo luogo, un sito di applicazione per il colorante deve essere scelto e tessuti estranei estratte per confermare visivamente il sito prescelto, e l'accesso per il posizionamento del colorante. La scelta del sito di applicazione è il passo più importante in questo processo. La scelta di un buon sito per etichettare la popolazione neuronale in esame e non le strutture estranee può essere impegnativo. La precisione del posizionamento in un dato tratto sotto controllo visivo nell'ambito dissezione richiede un certo livello di comprensione della neuroanatomia in questione. Colorante può essere impostata a livello centrale o periferico di etichettare proiezioni periferico o centrale, rispettivamente come necessari per un determinato progetto (cioè il cervello, nervi periferici, orecchio, occhio). Coloranti Lipophic sarà diffusa in tutti i processi appartenenti ad un dato neurone, sia retrograda e anterogradely, riempire un neurone dato o tutti i neuroni proiettano in una determinata traccia. NeuroVue colorante da MTTI è pre-caricato su strisce di filtro per una facile applicazione. Dye può anche essere sciolto in 100% DMSO (lavoro sotto il cofano) e capelli sottili possono essere immersi in questa soluzione e successivamente essiccati per piccole applicazioni. Il colorante precaricato carta da filtro viene tagliato in pezzi triangolari di dimensioni adeguate con microscissors. La dimensione del colorante dipenderà dalle dimensioni del campione, le dimensioni della struttura verrebbe introdotta l'etichetta e numero di colori utilizzati contemporaneamente. Assicuratevi di tagliare il più piccolo di un pezzo il più possibile per evitare l'etichettatura altre strutture. Dopo aver utilizzato microsissors per il taglio e pinze per la gestione del colorante agitare gli strumenti in alcool per rimuovere eventuali residui di colorante, poi asciugare completamente, o tamponare con carta. Questo per evitare di contaminare il campione con colorante residuo su strumenti che possono etichetta strutture indesiderate. Per l'inserimento dei tessuti molli come il cervello il filtro può essere inserito direttamente utilizzando un punto del triangolo filtro per forare il tessuto. Per ulteriori tessuti rigidi fare un'incisione per facilitare l'inserimento di colorante. Non usare un ago da dissezione per spingere filtro in tessuto. Ciò può causare il posizionamento impreciso e disgregazione del tessuto. Inserire lunghezze d'onda si alternano di NeuroVue colorante come necessario per l'etichettatura di ulteriori popolazioni neuronali. Dopo aver inserito il colorante, e verificando la sua posizione, i campioni sono posti in un flacone ben chiuso con il 4% PFA e incubato a 36 ° C al buio per 2-14 giorni a seconda dell'età e della distanza da coprire diffusione (circa 2 mm per giorni a 36 ° C). Un ambito dissezione con epiflouresence possono essere utilizzati per valutare se il colorante si è diffusa nella posizione desiderata, e il campione può essere rimesso in incubatrice se la diffusione è ritenuta insufficiente. Utilizzando un normale ambito dissezione senza epifluorescene per rilevare diffusione avverrà sottovalutare la vera lunghezza del colorante è diffusa. Inoltre, se la concentrazione colorante è abbastanza alto per valutare visivamente può causare tempra assorbimento quando si usa la fluorescenza emessa. Il tessuto di interesse desiderato è sezionato fuori e montato tutto su un vetrino con glicerolo e coperti per l'imaging con un microscopio confocale. Impostazioni confocale sono, come descritto in 1, 2. Se la dimensione dei tessuti inibisce l'intero montaggio su un vetrino, il sezionamento seriale è necessario (vedi sotto). Maggiori dettagli sulla preparazione dei tessuti per l'imaging e la tintura proprietà spettrali sono disponibili all'indirizzo: http://www.mtarget.com/mtti/documents/NeuroVuebrochuremar2010.pdf Figura 1. Schema di esperimento. L'orecchio è esposta per consentire la visualizzazione di tutte le strutture. Colorante lipofili viene quindi iniettato e il permesso di diffondere. Dopo la diffusione distinte popolazioni neuronali può essere visto etichettati dai coloranti diversi. Successivamente, ibridazione in situ (Sox2) viene eseguito su un orecchio e mRNA etichette espressione. L'immunoistochimica è poi svolta(Myo7, tubulina) di visualizzare l'espressione della proteina. Seguito da sezioni istologiche in cui entrambi ibridazione in situ e immunoistochimica possono essere visualizzati. 2. Ibridazione in situ Nel caso si voglia iniziare con ibridazione in situ (dopo la quale tracciare con coloranti lipofilici sarà impossibile), fare riferimento alla preparazione dei tessuti nella parte 1. Ogni lavaggio, se non indicato, viene effettuata con 2 ml di soluzione a temperatura ambiente su un inverter / mixer. Assicurati di lavorare in un ambiente pulito e libero RNasi. Disidratano e poi reidratare i campioni attraverso una serie graduata metanolo. 100% di 1 ora per notte @ 4 ° C (opzionale: conservare i campioni a -20 ° C a 100% metanolo) 75 x% 5 min. @ 4 ° C 50% x 5 min. @ 4 ° C 25% x 15 min. @ 4 ° C (o fino a quando affonda tessuto) Trasferire campioni ad un tubo di 2 ml Eppendorf (RNasi gratuito). Lavare tre volte in PBS (PBS 1x) e girare il fornetto per un uso futuro (60 ° C). PBS x 5 min. PBS x 5 min. PBS x 5 min. Tessuto digerire con 2 ml di 20 mg / mL magazzino proteinasi K (Ambion Cat # AM2546) in 2.0 ml PBS fresco. Il tempo effettivo di digestione PK dipende dall'età dell'embrione. La seguente è una stima approssimativa dei tempi. Digestione devono essere attentamente monitorati come deproteination è un passo critico. Under digestione si tradurrà in scarsa penetrazione della sonda, mentre troppo la digestione si tradurrà in una perdita di integrità strutturale. Un buon indicatore di digestione è un cambiamento nel tessuto da opaca a trasparente quasi. Tabella 1. Proteinasi K tempo di digestione sul tessuto del mouse. ETA '(giorno embrionale) TEMPO (minuti) E8.5 6 E9.5 10 10,5 13 E11.5 15 E12.5 17 E14.5 18 E16.5 + 20 + Interrompere la digestione incubando i campioni in PFA 4% per 5 min. Lavare in PBS. PBS x 1 min. PBS x 5 min. PBS x 5 min. PBS x 5 min. Eliminare PBS con particolare attenzione per eliminare il più possibile. Prehybridize campioni: Incubare a 60 ° C su inverter a 1,8 mix di ibridazione ml per almeno 1 ora. Imposta sul blocco termico Isotemp a 85 ° C per un uso futuro. Come un'ora si avvicina, denaturare il DNA dello sperma di salmone (Invitrogen Cat. No. 15632-011) da incubazione a 85 ° C per 10 min. Imposta sul ghiaccio fino al momento dell'uso. Dopo almeno 1 ora di prehybridization, aggiungere 200 microlitri ssDNA denaturato e circa 100 ng di DIG-etichettati riboprobe per ogni campione. Ibridare la notte a 60 ° C in forno di ibridazione. Sostituire il mix di ibridazione con 2 mL 2X SSC. Impostare blocchi di calore Isotemp a 37 ° C e 70 ° C per un uso futuro. Lavare con SSC 2X x 10 min. @ 60 ° C in forno di ibridazione. Lavare con SSC 2X x 10 min. @ 60 ° C in forno di ibridazione. Lavare con SSC 2X x 10 min. @ 60 ° C in forno di ibridazione. Lavare con SSC 2X x 60 min. @ 70 ° C in blocco calore Isotemp. 70 ° C rimuove qualsiasi attività endogena fosfatasi alcalina. Questo è forse il passo più importante verso la riduzione di fondo. Parte (d) può essere suddiviso in due 30 min. lavaggi per ridurre al minimo i danni ai tessuti. Lavare con PBS x 5 min. Disgelo Un enzima in ghiaccio per uso futuro RNasi. Sostituire PBS e aggiungere 1,0 ml di RNasi un enzima (Fermentas EN0531 10 mg / mL) x 60 min. @ 37 ° C in blocco termico Isotemp (a 90 min. Periodo di incubazione è preferibile se la sonda è altamente concentrato). Eliminare PBS / RNase A e lavare 4 volte. Soluzione di lavaggio 1X x 10 min. Soluzione di lavaggio 1X x 10 min. Soluzione di lavaggio 1X x 10 min. Soluzione di lavaggio 1X x 60 min. @ 70 ° C in blocco calore Isotemp. Incubare in 1X tampone di blocco per 1 ora. A questo punto, preparare 2,0 ml di buffer di blocco e di 1 ml (1:2000) anticorpi anti-digossigenina per campione. Invertire brevemente e lasciate riposare a 4 ° C fino all'utilizzo. Dopo 1 buffer di blocco scartare un'ora e aggiungere 2,0 ml di pre-assorbito buffer del blocco + anticorpi campioni. Incubare per una notte. Scartare la soluzione del blocco. Lavare con tampone di lavaggio 1X. 1X tampone di lavaggio x 5 min. 1X tampone di lavaggio x 5 min. 1X tampone di lavaggio per 1 ora x 5-6 modifiche. Lavare con tampone di lavaggio 1X durante la notte. Sciacquare con 1X detection tampone per 10 min. Trasferimento dei campioni nel buffer di rilevamento per pozzetti. Eliminare la soluzione tampone e di individuare con BM Viola (Roche 11442074001) fino a quando la potenza del segnale desiderato è ottenuto (con più sonde questo può significare una notte). BM viola è la luce sensibile coprire con un foglio o una scatola. Mescolare BM Viola bene prima dell'uso. Assicurarsi che i campioni sono flottanti libere e non attaccato alla pozzi. Controllare il segnale dopo 1 ora. Sciacquare campioni con tampone 1X rilevamento in pozzi x 5 min. Immagine o conservare i campioni in PFA 4% a 4 ° C. * I campioni possono essere esposte in questa fase e / o dopo la fase di immunoistochimica è aggiunto (Parte 3). Soluzioni: Acqua priva di nucleasi: Miscelare 1 ml DEPC (Sigma), con 1 litro di acqua ultrapura sterile. Autoclave. PBS 1X: Mix 1 PBS pacchetto (Sigma) in acqua priva di nucleasi 1L e filtro sterilizzare. La soluzione di lavaggio 1X: Mescolare 450 ml di acqua priva di nucleasi + 50 ml soluzione di lavaggio 10x e filtro sterilizzare. Ibridazione Mix: Formammide 50% in volume (25 ml); 2X SSC 50% in volume (25 ml); 6% di destrano solfato in massa (3g). 1X buffer di rilevamento: Mix buffer di 50 mL di rilevazione 10X con 450 mL di acqua priva di nucleasi e filtro sterilizzare. 1X buffer di blocco: 5 mL di tampone 10X acido maleico (Roche set di tamponi); 40 ml nucleasi acqua libera; Buffer 5 Block ml 10X. 2X SSC: Mescolare 50 ml di SSC 20x con 450 mL di acqua priva di nucleasi e filtro sterilizzare. Metanolo Graded: Diluire 100% metanolo con l'acqua priva di nucleasi al 75%, 50% e 25% delle concentrazioni. 3. Immunoistochimica Punti 1 e 2 possono essere omessi se 2 Parte è stato completato. In tal caso, assicurarsi che tutti glicerolo o altro supporto di montaggio è lavato via. Si noti che non tutti gli anticorpi sarà ancora in grado di rilevare la loro epitopo dopo digestione proteinasi K. Abbiamo una breve lista di anticorpi che possono essere utilizzati in combinazione con ibridazione in situ nei tessuti dei mammiferi in quanto conservano la loro specificità (vedi Tabella 2). Serie graduata di etanolo per liberare i tessuti di coloranti lipofili (se non completato per effetto nella Parte 2):.. 5min etanolo al 50%, 70% etanolo 5 min, 95-100% etanolo durante la notte o quando necessario fino a effetto desiderato, etanolo al 70% 5 min., 5min etanolo al 50%. Reidratare incrementale aggiungendo PBS in 5-10 minuti. Blocco di tessuto per 1 ora a 2,5% siero di capra normale (NGS) e 0,5% Triton X-100 @ RT su agitatore. (1:1 NGS 5%: 1,0% TritonX-100 in 1x PBS) Incubare con l'anticorpo primario (s) diluito in soluzione di blocco 48-72 ore a 4 ° C su agitatore. Lavare con PBS per 1 ora x 3 cambi. Blocco come al punto 3. Incubare con anticorpo secondario (s) diluito in soluzione di blocco per 24 ore @ 12-4 ° C su agitatore (Alexa Fluor coloranti ® sono stati utilizzati da Invitrogen). Lavare come al punto 5. (Opzione:.. Macchia contatore con Hoechst nucleare macchia come primo lavaggio diluita 10 mg / mL magazzino 1:2000 in PBS Seguire con 1 ora lavaggi in PBS x 2-3 cambi @ RT su agitatore) Imaging: I campioni possono essere esposte a questo passo sia con la trasmissione e la microscopia epifluorescente, preferibilmente utilizzando un sistema di imaging confocale per la risoluzione aggiunto. Per fare questo abbiamo regolarmente orecchie montare tutto in glicerolo con coprioggetto come distanziatori per evitare un'eccessiva compressione dei tessuti. In aggiunta o in sostituzione di questa immagine tutto il montaggio, i campioni possono essere incorporati nella resina epossidica e sezionato in serie per aggiungere dettagli istologici. Per beneficiare del combinato tutto mount / sezione di analisi, evitare di sbiancamento il segnale fluorescente nella fase di imaging confocale. Soluzioni Soluzioni di etanolo: etanolo al 100% Diluire in acqua distillata per concentrazioni finali del 50% e 70%. Blocca Soluzione: 1:1 NGS diluizione 5%: 1,0% TritonX-100 in PBS 1x (finale concentrazioni di lavoro: 2,5% NGS; 0,5% TritonX-100). PBS 1X: Mix 1 PBS pacchetto (Sigma) in 1 litro di acqua distillata. NGS 5%: 2,5 NGS Scongelate mL e miscelare con 47,5 ml di PBS 1x. Conservare a 4 ° C. 1,0% TritonX-100: Mix 49,5 ml 1x PBS con 0,5 ml TritonX-100 (lasciare su agitatore @ RT di mescolare per 1 ora). Conservare a 4 ° C. Hoechst soluzione macchia magazzino: sciogliere 10 mg di colorante Hoechst per millilitro di 1x PBS. Tabella 2. Gli anticorpi che funzionano con il tessuto proteinasi K digerito. Cat # Voce Vender 25-6790 Anti-miosina VII-policlonale Proteus Biosciences 25-6791 Anti-miosina-VI policlonale Proteus Biosciences 9661 Spaccati Caspase-3 policlonale Cell Signaling T7451 Anti-acetilati tubulina Monoclonal Sigma PRB-238C Policlonali Prox1 Covance 4. Istologia Istologia può essere introdotto dopo parte 1 per aumentare la risoluzione del colorante lipofile analisi in spessore monta tutto come i cervelli giovanile o dopo il completamento delle parti 2 o 3. Per le sezioni di cervello di serie si consiglia il VF-700 Compresstome microtomo (Precisionary Instruments Inc., Greenville, Carolina del Nord) per ottenere uno spessore uniforme sezione. Sezioni congelate sono meno ottimali a causa della maggiore perdita colorante durante il processo di sezionamento 3. Preparazione di sezioni seriali e montaggio in glicerolo 4 è il metodo preferito di preparazione dei tessuti quando monta intero o supporti di superficie non permettono la visualizzazione adeguata delle regioni tessuto di interesse. Tessuti possono anche essere successivamente inglobati in resina epossidica e tagliare a 1-2 micron di spessore con coltelli di vetro o di diamante per TEM. Quando si utilizza questa tecnica più immunofluorescenza rimane ed è ancora più stabile dopo inclusione, tuttavia, tutti lipofili tracciamento sarà perso interamente in questa fase, si sciolgono in alcool e resina epossidica. Prendere precauzioni come campioni sarà sensibile alla luce fino a quando non sono incorporati. Per Compresstome VF-700 sezionamento microtomo, seguire le raccomandazioni del Precisionary Instruments Inc. Epossidica Incorporare / sezionamento: Fissazione: 2,5% gluteraldehyde / 1% PFA in 0.1M tampone fosfato (pH 7,4) a 1 ora durante la notte. In un tessuto di vetro disidratano fiala campione: 30% di etanolo (5min.), 50% di etanolo (5min.), il 70% di etanolo (5min. per tutta la notte), il 95% di etanolo (10 minuti 5 volte ciascuno.) Ed etanolo assoluto (10min 5x . ciascuno). Transitorie solvente: 1:1 etanolo assoluto: ossido di propilene (PO) per 5 min. Solvente: PO 10min solo 5x. ciascuno. Infiltrazione di resina: 01:01 PO: pernottamento in resina shaker. Versare la soluzione con il campione (s) in forma embedding piatto e lasciare sul bancone 4-6 ore per far evaporare PO. In alternativa, rimuovere il tappo del flacone e lasciare in agitazione per 4 ore (funziona bene con i più grandi del tessuto). Trasferimento dei campioni al 100% resina per 4 ore. Incorpora in resina a forma finale con etichetta. Polimerizzare incubando a 60 ° C per 24-48 ore. Tagliare blocco con una lama di rasoio come necessario per ridurre al minimo resina estranei. Lasciare 1-2 sezioni um seriale su un Ultramicrotomo (una e Ultracut Reichert-Jung è stato utilizzato). Montaggio e l'immagine usando la microscopia epifluorescente. Opzionale: Macchia una parte delle sezioni con macchie istologiche (cioè Stevenel di blu) se lo si desidera (realizzare immunofluorescenza non sarà sostenuto in queste sezioni). Soluzioni Soluzioni di etanolo: Diluire 100% di etanolo in acqua distillata al 30%, 50%, 70% e 95% le concentrazioni. Fissazione soluzione: Mescolare 2,5 ml Gluteraldehyde 50%, 5 ml di paraformaldeide al 10%, e 42,5 mL di tampone fosfato 0.1M pH 7.4 (concentrazioni finali: 2,5% gluteraldehyde, 4% PFA). Conservare a 4 ° C. Resina epossidica: Fai in base alle istruzioni fornite con Poly / Letto 812 Incorporare Media/DMP-30 Kit (Polysciences, Inc. # 08792-1). Conservare a -20 ° C. 5. Rappresentante Risultati Figura 2. Lipofili posizionamento tintura e di imaging in un embrione di topo. Tre coloranti diversa lunghezza d'onda lipofile sono stati iniettati e incubate per consentire la visualizzazione del nervo trigemino (TN), nervo glossofaringeo (GN) e del nervo vago (VN), proiezioni centrali. A) il posizionamento colorante lipofili nelle porzioni periferiche di tre nervi cranici per consentire la diffusione del tronco cerebrale per la visualizzazione dei loro processi centrali. Il TN è etichettato con NeuroVue Rosso, GN: Maroon NeurVue, e VN: Jade NeuroVue. B) del mouse stesso come in (A), dopo incubazione. Alcuni diffusione può essere visto al microscopio campo chiaro. C) del mouse stesso come in (A e B). Il romboencefalo è stato sezionato e piatto montato. Alcuni etichettatura dei processi centrali dei tre nervi marcata può essere visto con il microscopio campo chiaro. D) Immagine confocale di (C). Con l'uso dei neuroni confocale specifico può essere visto, e l'uso di tre tinte differenti consente la valutazione della distribuzione di ciascuna popolazione in relazione agli altri. Tinture erano ripreso in sequenza. Jade NeuroVue stato fotografato ad una eccitazione di 488 nm ed emissione 500-550 nm. NeuroVue Rosso è stato fotografato ad una eccitazione di 535 nm ed emissione 550-600 nm. Maroon NeuroVue è stato fotografato ad una eccitazione di 643 nm ed emissione a 650-700 nm. Figura 3. Schema di esperimento. L'orecchio è esposta per consentire la visualizzazione di tutte le strutture. Colorante è lipofilapoi iniettato e il permesso di diffondere. Dopo la diffusione distinte popolazioni neuronali può essere visto etichettati dai coloranti diversi. Successivamente, ibridazione in situ (Sox2) viene eseguito su un orecchio e mRNA etichette espressione. L'immunoistochimica è poi svolta (Myo7, tubulina) di visualizzare l'espressione della proteina. Seguito da sezioni istologiche in cui entrambi ibridazione in situ e immunoistochimica possono essere visualizzati.