De combinatie van Lipophilic kleurstof, In situ Hybridisatie, immunohistochemie, en Histologie

1. Lipofiele Dye Injectie Tissue Bereiding: Alle weefsel dissecties en manipulaties worden uitgevoerd bij dieren gefixeerd in 4% paraformaldehyde (PFA) in 0,1 M fosfaatbuffer (pH 7,4) met transcardial perfusie met peristaltische pompen met de juiste maat naalden. Weefsel kan worden opgeslagen in 4% PFA in de koelkast voor maximaal 6 maanden. Alle voorbereidingen en manipulaties zijn uitgevoerd in 0,4% of hoger PFA tot de montage met glycerol voor de beeldvorming. Deze hoeveelheid PFA elimineert effectief RNases en behoudt zich het RNA in situ hybridisatie. Dye opslag: Alle kleurstoffen moeten worden opgeslagen in een donkere afgesloten compartiment om luchtcirculatie en de blootstelling aan helder daglicht te minimaliseren, zoals ze zijn lichtgevoelige. Om te voorkomen dat kruisbesmetting, moet een aparte set van instrumenten die worden gebruikt om elke kleurstof af te handelen. Ten eerste moet een aanvraag site voor de kleurstof worden gekozen en vreemde weefsel uitgepakt om visueel te bevestigen dat de gekozen locatie, en de toegang voor de plaatsing van de kleurstof. Het kiezen van de plaats van toediening is de belangrijkste stap in dit proces. Het kiezen van een goede site om de neuronale populatie label in aanmerking en niet vreemde structuren kunnen een uitdaging zijn. De nauwkeurigheid van de plaatsing in een bepaalde landstreek onder visuele controle bij het ontleden kader vereist een zekere mate van inzicht in de neuroanatomie in kwestie. Kleurstof kan centraal of perifeer geplaatst worden aan perifere of centrale projecties respectievelijk als nodig is voor een bepaald project (dat wil zeggen hersenen, perifere zenuwen, oor-, oog-) label. Lipophic kleurstoffen zullen verspreiden in alle processen die behoren tot een bepaald neuron, zowel retrogradely en anterogradely, het vullen van een bepaald neuron of alle neuronen projecteren in een bepaalde track. NeuroVue kleurstof uit MTTI is vooraf geladen op filter strips voor gemakkelijke toepassing. Kleurstof kan ook worden opgelost in 100% DMSO (werk onder de motorkap) en dun haar kan worden gedrenkt in deze oplossing en vervolgens gedroogd voor kleinere toepassingen. De voorgeladen filtreerpapier kleurstof wordt gesneden in de juiste grootte driehoekige stukken met microscissors. De grootte van de kleurstof zal afhangen van de grootte van het monster, de grootte van de structuur wordt gelabeld, en het aantal kleuren dat tegelijkertijd wordt gebruikt. Zorg ervoor dat u zo klein van stuk gesneden mogelijk om te voorkomen dat de etikettering van andere structuren. Na het gebruik van microsissors voor het knippen en tangen voor de behandeling van de kleurstof van de instrumenten bewegen in alcohol aan een kleurstof resten dan te verwijderen, de lucht drogen, of deppen met papier. Dit is om te voorkomen dat besmetting van het specimen met resterende kleurstof op instrumenten die eventueel label ongewenste structuren. Voor het inbrengen in zacht weefsel, zoals de hersenen van de filter kan direct worden ingevoegd met behulp van een punt van de driehoek filter te doorboren het weefsel. Voor meer rigide weefsel maken een incisie gemakkelijker inbrengen van kleurstof toe te staan. Geen gebruik maken van een dissectie naald te filteren duwen in het weefsel. Dit kan leiden tot onjuiste plaatsing en verstoring van het weefsel. Steek afwisselend golflengten van NeuroVue kleurstof als nodig is voor de etikettering van extra neuronale populaties. Na het inbrengen van de kleurstof, en verifiëren van zijn positie, zijn exemplaren geplaatst in een goed gesloten flacon met 4% PFA en geïncubeerd bij 36 ° C in het donker voor de 2-14 dagen afhankelijk van leeftijd en verspreiding af te leggen afstand (ongeveer 2 mm per dagen bij 36 ° C). Een ontleden bereik met epiflouresence kan worden gebruikt om te beoordelen of de kleurstof heeft verspreid naar de gewenste locatie, en het monster geplaatst kan worden terug in de incubator als de diffusie wordt geacht te zijn onvoldoende. Met behulp van een normale ontleding ruimte zonder epifluorescene om de verspreiding te detecteren zal onderschatten de werkelijke lengte van de kleurstof is diffuus. Ook als kleurstof de concentratie hoog genoeg is om te beoordelen visueel het kan leiden tot absorptie quenching wanneer er gebruik wordt uitgezonden fluorescentie. De gewenste weefsel van belang is ontleed uit en geheel aangebracht op een glijbaan met glycerol en afgedekt voor beeldvorming met een confocale microscoop. Confocale instellingen worden zoals beschreven in 1, 2. Als tissue grootte remt hele montage op een dia, is serieel snijden nodig is (zie hieronder). Meer details over de voorbereiding van weefsel voor beeldvorming en kleurstof spectrale eigenschappen zijn beschikbaar op: http://www.mtarget.com/mtti/documents/NeuroVuebrochuremar2010.pdf Figuur 1. Schematisch overzicht van experiment. Het oor is blootgesteld aan zorgen voor visualisatie van alle structuren. Lipofiele kleurstof wordt vervolgens geïnjecteerd en mag verspreiden. Na de verspreiding van verschillende neuronale populaties kan gezien worden bestempeld door de verschillende kleurstoffen. Vervolgens, in situ hybridisatie (Sox2) wordt uitgevoerd op het oor en labels mRNA expressie. Immunohistochemie wordt dan uitgevoerd(Myo7, tubuline) om eiwitexpressie te visualiseren. Gevolgd door histologische secties waarin zowel in situ hybridisatie en immunohistochemie kunnen worden gevisualiseerd. 2. In situ hybridisatie In het geval u wilt met start in situ hybridisatie (waarna tracing met lipofiele kleurstoffen zal het onmogelijk zijn), wordt verwezen naar het prepareren van weefsels in deel 1. Elke wasbeurt, tenzij anders aangegeven, is uitgevoerd met 2 ml van de oplossing bij kamertemperatuur op een omvormer / mixer. Zorg ervoor om te werken in een schone, RNase vrije omgeving. Vervolgens uitdrogen en rehydrateren monsters door een gegradeerde methanol serie. 100% 1 uur tot de volgende ochtend @ 4 ° C (optioneel: bewaren monsters bij -20 ° C in 100% methanol) 75% x 5 minuten. @ 4 ° C 50% x 5 minuten. @ 4 ° C 25% x 15 minuten. @ 4 ° C (of tot weefsel wasbakken) Overdracht monsters om een ​​2 ml Eppendorf buis (RNase vrij). Was drie keer in PBS (1x PBS) en zet hybridisatie oven op voor toekomstig gebruik (60 ° C). PBS x 5 minuten. PBS x 5 minuten. PBS x 5 minuten. Digest weefsel met 2 pl van 20 mg / ml bouillon Proteinase K (Ambion Cat # AM2546) in 2,0 ml verse PBS. Werkelijke PK spijsvertering tijd hangt af van de leeftijd van het embryo. Het volgende is een ruwe schatting van de tijd. Vertering moeten nauwlettend worden gecontroleerd deproteination is een kritieke stap. Onder-vergisting zal resulteren in een slechte sonde penetratie terwijl meer dan-vergisting zal resulteren in een verlies van de structurele integriteit. Een goede indicator van de spijsvertering is een verandering in het weefsel van dekkend tot bijna helder. Tabel 1. Proteinase K spijsvertering tijd op de muis weefsel. AGE (embryonale dag) Tijd (minuten) E8.5 6 E9.5 10 E10.5 13 E11.5 15 E12.5 17 E14.5 18 E16.5 + 20 + Stop spijsvertering door het incuberen monsters in 4% PFA gedurende 5 minuten. Wassen in PBS. PBS x 1 min. PBS x 5 minuten. PBS x 5 minuten. PBS x 5 minuten. Gooi PBS met bijzondere aandacht voor zo veel mogelijk te elimineren. Prehybridize monsters: Incubeer bij 60 ° C op omvormer in 1,8 ml hybridisatie mix voor minimaal 1 uur. Stel IsoTemp warmte te blokkeren tot 85 ° C voor toekomstig gebruik. Als een uur nadert, denatureren zalmsperma DNA (Invitrogen Cat No 15632-011) door incubatie bij 85 ° C gedurende 10 minuten. Zet op ijs tot gebruik. Na ten minste een uur van prehybridisatie, voeg 200 pi gedenatureerd ssDNA en ongeveer 100ng van de DIG-gelabelde riboprobe aan elk monster. Hybridiseren 's nachts bij 60 ° C in hybridisatie oven. Vervangen door hybridisatie mix met 2 ml 2X SSC. Stel IsoTemp warmte blokken tot 37 ° C en 70 ° C voor toekomstig gebruik. Was met 2X SSC x 10 minuten. @ 60 ° C in hybridisatie oven. Was met 2X SSC x 10 minuten. @ 60 ° C in hybridisatie oven. Was met 2X SSC x 10 minuten. @ 60 ° C in hybridisatie oven. Was met 2X SSC x 60 minuten. @ 70 ° C in IsoTemp hitte te blokkeren. 70 ° C verwijdert alle endogene alkalische fosfatase activiteit. Dit is misschien wel de belangrijkste stap op weg naar het verminderen van achtergrond. Deel (d) kan worden opgesplitst in twee 30 minuten. wast het minimaliseren van schade aan weefsel. Was met PBS x 5 minuten. Dooi RNase Een enzym op ijs voor toekomstig gebruik. Vervanging van PBS en voeg 1,0 pi van RNase A Enzyme (Fermentas EN0531 10 mg / ml) x 60 minuten. @ 37 ° C in IsoTemp hitte blok (een 90 min.. Incubatietijd heeft de voorkeur als de sonde is zeer geconcentreerd). Gooi PBS / RNase A en was vier keer. 1X wasoplossing x 10 minuten. 1X wasoplossing x 10 minuten. 1X wasoplossing x 10 minuten. 1X wasoplossing x 60 minuten. @ 70 ° C in IsoTemp hitte te blokkeren. Incubeer in 1X Block buffer voor 1 uur. Op dit moment bereiden 2,0 mL van het blok buffer en een pi (1:2000) Anti-digoxigenine antilichaam per monster. Omkeren kort en laat zitten bij 4 ° C tot gebruik. Na 1 uur weggooien block buffer en voeg 2,0 mL pre-geabsorbeerd block buffer + antilichaam tegen monsters. Incubeer overnacht. Gooi blok oplossing. Was met 1X wasbuffer. 1X wasbuffer x 5 minuten. 1X wasbuffer x 5 minuten. 1X wasbuffer gedurende 1 uur x 5-6 veranderingen. 'S nachts wassen met 1X wasbuffer. Spoelen met 1X detection buffer gedurende 10 minuten. Overdracht monsters in detectie-buffer om goed plaat. Verwijder de buffer en detecteren met BM Purple (Roche 11442074001) totdat het gewenste signaal sterkte wordt verkregen (met een langere probes kan dit betekenen 's nachts). BM paars is gevoelig voor licht bedekken met folie of een doos. Meng BM Purple goed voor gebruik. Zorg ervoor dat de monsters zijn vrij zwevende en niet vast aan putten. Controleer het signaal na 1 uur. Spoel monsters met 1X detectie buffer in putten x 5 minuten. Afbeelding of op te slaan monsters in 4% PFA bij 4 ° C. * Monsters kunnen worden afgebeeld in dit stadium en / of na de immunohistochemie een stap wordt toegevoegd (deel 3 hieronder). Oplossingen: Nuclease gratis water: Mix 1 mL DEPC (Sigma) met 1 liter steriel ultrapuur water. Autoclaaf. 1X PBS: Mix 1 PBS pakket (Sigma) in 1L nuclease gratis water en filter steriliseren. 1X Wash oplossing: Mix 450 ml nuclease gratis water + 50 ml 10x wasoplossing en filter steriliseren. Hybridisatie Mix: 50% formamide in volume (25 ml), 50% 2X SSC in volume (25 ml), 6% dextransulfaat massa (3g). 1X Detectie Buffer: Meng 50 ml 10x detectie buffer met 450 ml nuclease gratis water en filter steriliseren. 1X Block Buffer: 5 ml 10x maleïnezuur Buffer (Roche buffer set), 40 ml nuclease vrij water, 5 ml 10X Block Buffer. 2X SSC: Meng 50 ml 20x SSC steriliseren met 450 ml nuclease gratis water en filter. Graded methanol: Verdun 100% methanol met nuclease vrij water tot 75%, 50% en 25% concentraties. 3. Immunohistochemie De stappen 1 en 2 kan weggelaten worden als deel 2 was voltooid. In dat geval ervoor zorgen dat alle glycerol of andere montage medium is weggespoeld. Merk op dat niet alle antistoffen nog steeds in staat zijn om hun epitoop sporen na proteinase K spijsvertering. We hebben een korte lijst van antilichamen die kunnen in combinatie met gebruikt worden in situ hybridisatie in weefsel van zoogdieren zoals ze behouden hun specificiteit (zie tabel 2). Ethanolreeks om weefsel van lipofiele kleurstoffen (indien nog niet voltooid van kracht in deel 2) af:.. 50% ethanol 5min, 70% ethanol 5 min, 95-100% ethanol 's nachts of als nodig is totdat het gewenste effect, 70% ethanol 5 min., 50% ethanol 5min. Hydrateren door stapsgewijs toe te voegen PBS in 5-10 minuten. Block weefsel gedurende 1 uur in 2,5% normaal geit serum (NGS) en 0,5% Triton X-100 @ RT op shaker. (1:01 5% NGS: 1,0% TritonX-100 in 1x PBS) Incubeer met primaire antilichaam (s) verdund in blok oplossing 48-72 uur @ 4 ° C op shaker. Was met PBS voor 1 uur x 3 veranderingen. Blok zoals in stap 3. Incubeer met secundaire antilichaam (s) verdund in blok-oplossing voor de 12-24 uur @ 4 ° C op schudapparaat (Alexa Fluor ® kleurstoffen van Invitrogen werden gebruikt). Was als in stap 5. (Optie:.. Teller vlek met Hoechst nucleaire vlek als eerste wasbeurt verdund 10 mg / ml bouillon 1:2000 in PBS Volg met 1 uur wassen in PBS x 2-3 veranderingen @ RT op shake) Beeldvorming: Modellen kunnen worden afgebeeld bij deze stap met zowel transmissie en epifluorescerende microscopie, bij voorkeur met behulp van een confocale imaging-systeem voor extra resolutie. Om dit te doen we regelmatig hele monteren oren in glycerol met behulp van dekglaasjes als afstandhouders om te voorkomen dat compressie van het weefsel. Naast of in plaats van dit hele berg beeldvorming, kan exemplaren worden ingebed in epoxyhars en serieel coupes voor extra histologische details. Om te profiteren van de gecombineerde hele mount / sectie-analyse, te vermijden bleken het fluorescerende signaal in de confocale beeldvorming stap. Oplossingen Ethanol oplossingen: Verdun 100% ethanol in gedestilleerd water tot eindconcentraties van 50% en 70%. Block Oplossing: 1:01 verdunnen 5% NGS: 1,0% TritonX-100 in 1x PBS (laatste werken concentraties: 2,5% NGS; 0,5% TritonX-100). 1X PBS: Mix 1 PBS pakket (Sigma) in 1L gedestilleerd water. 5% NGS: Dooi 2,5 mL NGS en meng met 47,5 ml 1x PBS. Bewaren bij 4 ° C. 1,0% TritonX-100: Mix 49.5 ml 1x PBS met 0,5 ml TritonX-100 (achter op shaker @ RT te mengen gedurende 1 uur). Bewaren bij 4 ° C. Hoechst vlek voorraadoplossing: Los 10 mg Hoechst kleurstof per milliliter 1x PBS. Tabel 2. Antilichamen die werken met proteinase K verteerd weefsel. Cat # Item Verkoper 25-6790 Anti-myosine-VIIA Polyclonal Proteus Biosciences 25-6791 Anti-myosine-VI Polyclonal Proteus Biosciences 9661 Gesplitst caspase-3 Polyclonal Cell Signaling T7451 Anti-Geacetyleerd Tubuline Monoclonal Sigma PRB-238C Prox1 polyklonale Covance 4. Histologie Histologie kan worden ingevoerd na deel 1 de resolutie van de lipofiele kleurstof tracing in dikke hele mounts, zoals jeugdige hersenen of na afloop van deel 2 of 3 te verhogen. Voor seriële hersenen secties adviseren wij de Compresstome VF-700 microtoom (Precisionary Instruments Inc, Greenville, North Carolina) om een ​​uniforme sectie dikte te verkrijgen. Vriescoupes zijn minder optimaal te wijten aan een grotere kleurstof lekken tijdens het snijden proces 3. De voorbereiding van de seriële secties en montage in glycerol 4 is de voorkeur van het weefsel preparaat bij gehele mounts of oppervlaktewater mounts niet voor voldoende visualisatie van weefsel gebieden van belang. Weefsel kan ook achteraf worden ingebed in epoxyhars en snijd bij 1-2 micrometer dikte met behulp van glas of diamanten messen voor TEM. Bij het gebruik van deze techniek het meest immunofluorescentie zullen blijven en is nog stabieler na plastische inbedding zal echter alle lipofiele tracing volledig verloren gaan in deze fase als ze oplossen in alcohol en epoxy hars. Neem voorzorgsmaatregelen als monsters lichtgevoelige worden totdat ze zijn ingebed. Voor Compresstome VF-700 microtoom snijden, volg dan de aanbevelingen van Precisionary Instruments Inc Epoxy Inbedding / Sectioning: Fixatie: 2,5% gluteraldehyde / 1% PFA in 0,1 M fosfaatbuffer (pH 7,4) 1 uur tot 's nachts. In een glazen monsterflesje uitdrogen weefsel: 30% ethanol (5min.), 50% ethanol (5min.), 70% ethanol (5min. om 's nachts), 95% ethanol (5x 10min per stuk.), En de absolute ethanol (5x 10min . elk). Transitional Oplosmiddel: 01:01 absolute ethanol: propyleenoxide (PO) gedurende 5 minuten. Oplosmiddel: PO slechts 5x 10min. elk. Infiltratie met hars: 01:01 PO: hars 's nachts op shaker. Giet oplossing met monster (s) in platte inbedding vorm en laat op tegen 4-6 uur naar PO verdampen. Als alternatief, verwijder dop van flesje en laat op de shaker voor 4 uur (werkt goed met grotere weefsel). Overdracht monsters naar 100% hars voor 4 uur. Insluiten in hars in definitieve mal met label. Polymeriseren door incubatie bij 60 ° C gedurende 24-48 uur. Gesneden blok met een scheermes als nodig is om vreemde hars te minimaliseren. Snijd 1-2 um seriële secties over een ultramicrotoom (een Ultracut E Reichert-Jung werd gebruikt). Monteren en afbeelding met behulp van epifluorescerende microscopie. Optioneel: Stain een deel van de secties met histologische vlekken (dat wil zeggen Stevenel de blauwe) indien gewenst (te realiseren immunofluorescentie zal niet worden ondersteund in deze secties). Oplossingen Ethanol oplossingen: Verdun 100% ethanol in gedestilleerd water tot 30%, 50%, 70%, en 95% concentraties. Fixatie oplossing: Mix 2,5 ml 50% gluteraldehyde, 5 ml 10% Paraformaldehyde, en 42,5 mL 0,1 M fosfaatbuffer pH 7,4 (eind concentraties: 2,5% gluteraldehyde; 4% PFA). Bewaren bij 4 ° C. Epoxy Hars: Maak volgens de instructies die met Poly / Bed 812 Embedding Media/DMP-30 Kit (Polysciences, Inc # 08792-1). Bewaren bij -20 ° C. 5. Representatieve resultaten Figuur 2. Lipofiele kleurstof plaatsing en beeldvorming in een muis embryo. Drie verschillende golflengte lipofiele kleurstoffen werden geïnjecteerd en geïncubeerd voor de visualisatie van de nervus trigeminus (TN), glossopharyngeus zenuw (GN) en de nervus vagus (VN) centrale projecties mogelijk te maken. A) Lipophilic kleurstof plaatsing in de perifere delen van drie hersenzenuwen diffusie toelaten de hersenstam voor de visualisatie van hun centrale processen. De TN is gelabeld met NeuroVue Rood, GN: NeurVue Maroon, en de VN: NeuroVue Jade. B) Zelfde als de muis in (A) na incubatie. Sommige diffusie kan gezien worden met helderveld microscopie. C) Zelfde als de muis in (A en B). De achterhersenen is ontleed en plat gemonteerd. Enkele kenmerken van de centrale processen van de gelabelde drie zenuwen kan gezien worden met helderveld microscopie. D) Confocale beeld van de (C). Met gebruik van de confocale specifieke neuronen kan worden gezien, en het gebruik van drie verschillende kleurstoffen maakt voor de beoordeling van de verdeling van elke populatie in relatie tot de anderen. Kleurstoffen werden opeenvolgend afgebeeld. NeuroVue Jade werd in beeld gebracht op een excitatie van 488 nm en emissie 500 tot 550 nm. NeuroVue Red werd in beeld gebracht op een excitatie van 535 nm en emissie 550 tot 600 nm. NeuroVue Maroon werd in beeld gebracht op een excitatie van 643 nm en emissie bij 650 tot 700 nm. Figuur 3. Schematisch overzicht van het experiment. Het oor is blootgesteld aan zorgen voor visualisatie van alle structuren. Lipofiele kleurstof isvervolgens geïnjecteerd en mag verspreiden. Na de verspreiding van verschillende neuronale populaties kan gezien worden bestempeld door de verschillende kleurstoffen. Vervolgens, in situ hybridisatie (Sox2) wordt uitgevoerd op het oor en labels mRNA expressie. Immunohistochemie wordt dan uitgevoerd (Myo7, tubuline) om eiwitexpressie te visualiseren. Gevolgd door histologische secties waarin zowel in situ hybridisatie en immunohistochemie kunnen worden gevisualiseerd.