שילוב של צבע lipophilic, באתרו, אימונוהיסטוכימיה ו היסטולוגיה

1. הזרקת דיי lipophilic רקמות אופן ההכנה: והניתוחים כל רקמה ומניפולציות מבוצעות בבעלי חיים קבוע paraformaldehyde 4% (PFA) במאגר M 0.1 פוספט (pH 7.4) על ידי זלוף transcardial באמצעות משאבות peristaltic עם מחטים בגודל מתאים. רקמות ניתן לאחסן PFA 4% במקרר עד 6 חודשים. כל ההכנות ומניפולציות נערכים 0.4% או יותר עד PFA גובר עם גליצרול הדמיה. זו כמות PFA ביעילות מבטלת RNases ושומרת על רנ"א עבור ב הכלאה באתרה. דיי אחסון: צובעת כל יש לאחסן בתא סגור חשוך כדי למזער את זרימת האוויר ואת החשיפה לאור יום בהיר, כפי שהם רגישים לאור. כדי למנוע זיהום לחצות, סט נפרד של מכשירים יש להשתמש כדי לטפל בכל צבע. ראשית, האתר בקשה צבע חייב להיבחר ורקמות זרים חילוץ כדי חזותית לאשר את האתר הנבחר, וגישה עבור מיקום של הצבע. בחירת אתר יישום הוא השלב החשוב ביותר בתהליך זה. בחירת אתר טוב התווית האוכלוסייה העצבית הנדונה ולא מבנים זרים יכול להיות מאתגר. הדיוק של המיקום לתוך מערכת נתונה תחת שליטה חזותית בהיקף לנתח דורש רמה מסוימת של הבנה של neuroanatomy הנדון. דאי יכול להיות ממוקם באופן מרכזי או שולי תווית תחזיות היקפי או מרכזי צורך בהתאמה כמו לפרויקט מסוים (כלומר, המוח, העצבים ההיקפיים, אוזניים, עיניים). צבעים Lipophic יהיה מפוזר בכל התהליכים השייכים נוירון נתון, הן retrogradely ו anterogradely, מילוי נוירון נתון או כל הנוירונים מקרין לתוך מסלול נתון. NeuroVue צבע מן MTTI מגיע טעון מראש על רצועות מסנן עבור יישום קל. דאי יכול גם להיות מומס DMSO 100% (עבודה מתחת למכסה המנוע) ו שיער דליל יכול להיות טבול הפתרון הזה מיובשים לאחר מכן עבור יישומים קטנים יותר. לצבוע מראש נייר סינון לחתוך לחתיכות בגודל מתאים משולש עם microscissors. גודלו של צבע יהיה תלוי בגודל הדגימה, גודל המבנה להיות מתויג, ואת מספר הצבעים בשימוש בו זמנית. הקפידו לחתוך קטן כמו של פיסת ככל האפשר כדי למנוע תיוג ומבנים אחרים. לאחר השימוש microsissors לחיתוך מלקחיים לטיפול לצבוע להתסיס את המכשירים אלכוהול כדי להסיר שאריות צבע, אז אוויר יבש לחלוטין, או טיפה עם נייר. זה כדי למנוע לזהם את הדגימה עם צבע שיורי על מכשירים שעשויים תווית מבנים לא רצויים. עבור הכניסה לתוך רקמות רכות כגון המוח מסנן יכול להיות מוכנס ישירות באמצעות נקודה של המשולש לסנן לרקמה לחדור. עבור רקמות נוקשה יותר לעשות חתך כדי לאפשר החדרה קלה יותר של צבע. אין להשתמש איזמל המנתחים לדחוף לסנן לתוך הרקמה. זה יכול לגרום לשיבוש מיקום מדויק של הרקמה. הכנס אורכי גל חלופיות NeuroVue צבען לפי הצורך עבור תיוג של אוכלוסיות נוירונים נוספים. לאחר הוספת צבע, ואימות עמדתה, דגימות ממוקמים בקבוקון סגור היטב עם PFA 4% ו מודגרות ב 36 ° C בחושך במשך 2-14 ימים בהתאם לגיל ומרחק דיפוזיה להיות מכוסה (כ 2 מ"מ לכל היום בשעה 36 ° C). היקף לנתח עם epiflouresence ניתן להשתמש כדי להעריך אם יש לצבוע מתפזרת אל המיקום הרצוי, ואת הדגימה ניתן להציב בחזרה בחממה אם דיפוזיה נחשבת מספיקה. שימוש היקף הניתוחים נורמלי ללא epifluorescene לזהות דיפוזיה יהיה לזלזל אורך נכון לצבוע יש מתפזרת. כמו כן, אם ריכוז לצבוע גבוה מספיק כדי התחת חזותית הוא עלול לגרום מרווה ספיגת הקרינה הנפלטת בעת שימוש. הרקמה הרצויה של הריבית גזור החוצה כולו מותקן על גבי שקופית עם גליצרול coverslipped עבור דימות באמצעות מיקרוסקופ confocal. הגדרות Confocal הם כמתואר 1, 2. אם גודל רקמות מעכב כל הרכבה בשקופית, חתך סדרתי נדרש (ראה להלן). פרטים נוספים על ההכנות של רקמת עבור דימות ספקטרלי ותכונות צבע זמינים בכתובת: http://www.mtarget.com/mtti/documents/NeuroVuebrochuremar2010.pdf באיור 1. סקירה סכמטי של הניסוי. האוזן חשוף כדי לאפשר הדמיה של מבנים כל. לצבוע lipophilic מוזרק אז מותר מפוזר. לאחר דיפוזיה באוכלוסיות עצביות שונות ניתן לראות שכותרתו על ידי צבעים שונים. לאחר מכן, הכלאה באתרו (Sox2) מבוצע על האוזן ותוויות ביטוי ה-mRNA. אימונוהיסטוכימיה מבוצעת לאחר מכן החוצה(Myo7, טובולין) לדמיין ביטוי חלבון. ואחריו סעיפים היסטולוגית שבה הן הכלאה אימונוהיסטוכימיה באתרו ניתן דמיינו. 2. באתרו של הכלאה במקרה אתה רוצה להתחיל עם ב הכלאה באתרו (לאחר מעקב עם צבעים lipophilic יהיה בלתי אפשרי), עיין הכנת הרקמה חלק 1. לשטוף כל, אלא אם צוין, מתבצעת עם 2 מ"ל של תמיסת בטמפרטורת החדר על מהפך / מיקסר. הקפד לעבוד בסביבה נקייה RNase, בחינם. מייבשים ואז רעננותם דגימות באמצעות סדרה מתנול מדורגים. 100% 1 שעה לילה @ 4 ° C (לא חובה: דגימות חנות ב -20 מעלות צלזיוס מתנול 100%) 75% x 5 דקות. @ 4 ° C 50% x 5 דקות. @ 4 ° C 25% x 15 דקות. @ 4 ° C (או עד כיורים רקמה) העברת דגימות של 2 מ"ל Eppendorf צינור (RNase חינם). לשטוף שלוש פעמים PBS (1x PBS) ולהפוך את התנור על הכלאה לשימוש עתידי (60 ° C). PBS x 5 דקות. PBS x 5 דקות. PBS x 5 דקות. תקציר רקמה עם μL 2 של 20 מג / מ"ל ​​מניות proteinase K (חתול Ambion # AM2546) ב 2.0 מ"ל טרי PBS. זמן בפועל העיכול PK תלוי גיל העובר. להלן אומדן גס של פעמים. עיכול צריך להיות פיקוח הדוק כמו deproteination הוא שלב קריטי. תת העיכול תגרום חדירה בדיקה העניים בעוד יתר העיכול תגרום לאובדן של שלמות מבנית. אינדיקטור טוב של מערכת העיכול הוא שינוי ברקמת מאטום כמעט ברור. טבלה 1. Proteinase K זמן העיכול על רקמות העכבר. גיל (יום עובריים) זמן (דקות) E8.5 6 E9.5 10 E10.5 13 E11.5 15 E12.5 17 E14.5 18 E16.5 + 20 + עצור לעיכול על ידי דוגרים דגימות PFA 4% עבור 5 דקות. שטפי ב PBS. PBS x 1 דקות. PBS x 5 דקות. PBS x 5 דקות. PBS x 5 דקות. בטל PBS תשומת לב מיוחדת כדי לחסל כמה שיותר. Prehybridize דוגמאות: דגירה ב 60 ° C על מהפך בתמהיל 1.8 מ"ל הכלאה במשך שעה לפחות 1. הגדר לחסום IsoTemp חום עד 85 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי. בתור אחד שעה מתקרב, סלמון לפגל זרע DNA (Invitrogen חתול מספר 15632-011) על ידי הדגירה על 85 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הגדר על הקרח עד לשימוש. אחרי שעה לפחות 1 של prehybridization, להוסיף 200 ssDNA מפוגל μL ו 100ng של כ riboprobe-DIG שכותרתו מדגם זה. להכליא בין לילה ב 60 ° C בתנור הכלאה. החלף לערבב הכלאה עם 2 מ"ל 2X SSC. הגדר חוסמת IsoTemp חום 37 מעלות צלזיוס ו 70 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי. לשטוף עם דקות 2X 10 x SSC. @ 60 ° C בתנור הכלאה. לשטוף עם דקות 2X 10 x SSC. @ 60 ° C בתנור הכלאה. לשטוף עם דקות 2X 10 x SSC. @ 60 ° C בתנור הכלאה. לשטוף עם דקות 2X 60 x SSC. @ 70 מעלות חום לחסום IsoTemp. 70 ° C מסיר כל פעילות אנדוגני phosphatase אלקליין. זה אולי הצעד המשמעותי ביותר לקראת צמצום רקע. חלק א (ד) יכול להיות מחולק 30 דקות השניים. שוטף כדי למזער את הנזק לרקמות. לשטוף עם PBS 5 דק 'x. הפשירי RNase האנזים על הקרח לשימוש עתידי. החלף PBS ולהוסיף 1.0 μL של אנזים RNase (Fermentas EN0531 10 מ"ג / מ"ל) x 60 דקות. @ 37 מעלות חום לחסום IsoTemp (90 min. תקופת הדגירה היא המועדפת אם בדיקה מרוכז מאוד). בטל PBS / RNase לשטוף 4 פעמים. 1X פתרון לשטוף x 10 דקות. 1X פתרון לשטוף x 10 דקות. 1X פתרון לשטוף x 10 דקות. 1X פתרון לשטוף x 60 דקות. @ 70 מעלות חום לחסום IsoTemp. מדגירים את הצפת 1X חסום במשך שעה 1. בשלב זה, להכין 2.0 מ"ל של חיץ לחסום 1 μL (1:2000) Anti-Digoxigenin נוגדן לדגימה. היפוך בקצרה ולתת לשבת 4 ° C עד השימוש. לאחר 1 שעה חיץ להשליך בלוק ומוסיפים 2.0 מ"ל מראש נספג חיץ לחסום + נוגדנים דגימות. דגירה בין לילה. בטל פתרון לחסום. לשטוף עם חיץ 1X לשטוף. 1X לשטוף חיץ x 5 דקות. 1X לשטוף חיץ x 5 דקות. 1X לשטוף חיץ במשך שעה 1 x 5-6 שינויים. לשטוף עם חיץ 1X לשטוף לילה. לשטוף עם 1X detection חיץ עבור 10 דקות. העברת הדגימות במאגר זיהוי הצלחת היטב. הסר חוצץ לזהות עם BM סגול (רוש 11442074001) עד עוצמת האות הרצוי מתקבל (עם בדיקות יותר זה כנראה אומר לילה). BM סגול היא לכסות בנייר כסף רגישים לאור או קופסה. מערבבים BM סגול היטב לפני השימוש. ודא כי דגימות צפים חופשית לא נדבק בארות. בדוק אות אחרי שעה 1. לשטוף עם דגימות למאגר זיהוי 1X ב 5 דקות בארות x. תמונה או דגימות חנות PFA 4% ב 4 ° C. * דוגמאות ניתן הדמיה בשלב זה ו / או לאחר השלב אימונוהיסטוכימיה נוסף (חלק 3 להלן). פתרונות: Nuclease מים חינם: מערבבים 1 מ"ל DEPC (סיגמא) עם 1 ליטר מים ultrapure סטרילית. החיטוי. 1X PBS: מערבבים 1 PBS מנות (Sigma) 1 ליטר מים חינם nuclease ולסנן לעקר. 1X פתרון שטפי: מערבבים 450 מ"ל מים nuclease חינם + 50 מ"ל פתרון לשטוף לסנן 10x ו לעקר. מערבבים Hybridization: לפוראמיד 50% לפי נפח (25 מ"ל); 50% 2X SSC לפי נפח (25 מ"ל); 6% סולפט dextran ידי המסה (דור 3). 1X מאגר זיהוי: 50 מ"ל מערבבים חיץ 10X זיהוי עם 450 מ"ל מים חינם nuclease ולסנן לעקר. 1X הצפת בלוק: 10X 5 מ"ל הצפת Maleic חומצה (רוש לקבוע חיץ); 40 מ"ל מים nuclease חופשית; 5 הצפת 10X מ"ל חסום. 2X SSC: לערבב 50 מ"ל 20X SSC עם 450 מ"ל מים חינם nuclease ולסנן לעקר. מתנול מדורגים: 100% מתנול מדולל במים nuclease חופשי 75%, 50% ו 25% בריכוז. 3. אימונוהיסטוכימיה שלבים 1 ו -2 ניתן להשמיט אם חלק 2 הושלמה. במקרה זה, לוודא שכל גליצרול או בינוני הרכבה השני הוא לשטוף. שים לב שלא כל הנוגדנים עדיין יהיה מסוגל לזהות epitope שלהם לאחר עיכול K proteinase. יש לנו רשימה קצרה של נוגדנים, שניתן להשתמש בהם בשילוב עם ב הכלאה באתרו ברקמות יונקים כפי שהם שומרים על הייחודיות שלהם (ראה טבלה 2). סדרת אתנול מדורגים להיפטר רקמה של צבעים lipophilic (אם לא השלים את אפקט חלק 2):.. 5min אתנול 50%, 70% 5 דקות אתנול, 95-100% אתנול צורך הלילה או עד האפקט הרצוי, אתנול 70% 5 דקות., 5min אתנול 50%. רעננותם באופן הדרגתי על ידי הוספת PBS ב 5-10 דקות. בלוק רקמה שעה 1 ב -2.5% עז בסרום נורמלי (NGS) ו 0.5% Triton X-100 @ RT על שייקר. (01:01 NGS 5%: 1.0% TritonX-100 ב 1x PBS) דגירה עם נוגדן ראשוני (ים) מדולל פתרון לחסום 48-72 שעות @ 4 ° C על שייקר. לשטוף עם PBS עבור x 1 שעות 3 שינויים. בלוק כמו בשלב 3. דגירה עם נוגדנים משני (ים) מדולל פתרון לחסום עבור 12-24hrs @ 4 ° C על שייקר (אלקסה פלואוריד צבעים ® מן Invitrogen היו בשימוש). שטפו כמו בשלב 5. (אפשרות:.. נגד כתם עם כתם Hoechst גרעיני כמו ליטול ידיים לדלל 10 מ"ג / מ"ל ​​מניות 1:2000 ב PBS פעל עם 1 hr שוטף ב PBS x 2-3 שינויים RT @ על שייקר) הדמיה: דוגמאות ניתן הדמיה בשלב הזה עם הילוכים וגם במיקרוסקופ epifluorescent, מעדיפים באמצעות מערכת הדמיה confocal לפתרון הוסיף. לשם כך אנו אוזניים באופן שגרתי הר שלם גליצרול באמצעות coverslips כמו מפרידי להימנע על דחיסה של הרקמה. בנוסף או במקום הדמיה הזה הר שלמה, דגימות יכול להיות מוטבע בתוך שרף אפוקסי מחולק סדרתי לפרטים היסטולוגית הוסיף. כדי ליהנות מן ניתוח משולב הר / קטע שלם, למנוע הלבנת אות ניאון בשלב הדמיה confocal. פתרונות אתנול פתרונות: 100% אתנול מדולל במים מזוקקים לריכוזים סופי של 50% ו -70%. הפתרון בלוק: 01:01 NGS דילול 5%: 1.0% TritonX-100 ב 1x PBS (ריכוזים עובד סופי: NGS 2.5%, 0.5% TritonX-100). 1X PBS: מערבבים 1 PBS מנות (Sigma) ב 1 ליטר מים מזוקקים. 5% NGS: הפשירי 2.5 NGS מ"ל ומערבבים עם 47.5 מ"ל 1x PBS. חנות ב 4 ° C. 1.0% TritonX-100: ערבבו 49.5 מ"ל 1x PBS עם 0.5 מ"ל TritonX-100 (להשאיר על שייקר RT @ לערבב במשך שעה 1). חנות ב 4 ° C. Hoechst פתרון מניות כתם: להמיס 10 מ"ג Hoechst לצבוע למיליליטר של 1x PBS. טבלה 2. נוגדנים הפועלים עם רקמה K proteinase מעוכל. חתול # פריט מוכר 25-6790 Anti-שרירן-VIIA polyclonal פרוטאוס Biosciences 25-6791 Anti-שרירן-VI polyclonal פרוטאוס Biosciences 9661 ביקע caspase-3 polyclonal תא האיתות T7451 Anti-Acetylated טובולין Monoclonאל סיגמא PRB-238C Polyclonal Prox1 Covance 4. היסטולוגיה היסטולוגיה ניתן שהוכנסו לאחר חלק 1 להגדיל את הרזולוציה של הצבע lipophilic התחקות ב mounts שלם עבה כמו מוחות צעירים או לאחר השלמת חלקים 2 או 3. עבור חלקים במוח סדרתי אנו ממליצים על VF-700 Compresstome microtome (Precisionary מכשירים בע"מ, גרינוויל, צפון קרוליינה) כדי להשיג עובי סעיף אחיד. חלקים קפואים הם אופטימליים פחות בשל זליגת צבע יותר בתהליך חתך 3. הכנת חלקים סדרתי גובר גליצרול 4 היא השיטה המועדפת של הכנת הרקמה כולה או כאשר עולה עולה לפני השטח אינן מאפשרות ראיה מספקת של רקמות באזורים של עניין. רקמות יכולים גם להיות מוטבע לאחר מכן שרף אפוקסי וחותכים את עובי 1-2 מיקרומטר באמצעות סכינים זכוכית או יהלום TEM. כאשר משתמשים בטכניקה זו ביותר immunofluorescence יישאר והוא גם יציב יותר לאחר הטבעה הפלסטיק, עם זאת, מעקב אחר כל lipophilic יאבדו לחלוטין בשלב זה כפי שהם נמסים באלכוהול שרף אפוקסי. קח זהירות כמו דגימות יהיה רגיש לאור עד שהם מוטבעים. עבור חתך Compresstome VF-700 microtome, בצע את המלצות Precisionary מכשירים בע"מ אפוקסי והטבעה / חתך: קיבוע: 2.5% gluteraldehyde / PFA 1% ב 0.1M פוספט חיץ (pH 7.4) 1 שעות עד לילה. בתוך רקמת זכוכית מדגם מייבשים בקבוקון: אתנול 30% (5min.), אתנול 50% (5min.), אתנול 70% (עד 5min. לילה), אתנול 95% (10min 5x כל אחד.) ואתנול המוחלט (10min 5x . כל אחד). מעבר מרכך: 01:01 אתנול אבסולוטי: פרופילן אוקסיד (PO) במשך 5 דקות. מרכך: 10min 5x רק PO. כל אחד מהם. הסתננות עם שרף: 01:01 ת.ד.: לילה שרף על שייקר. יוצקים פתרון עם דגימה (ים) לתוך תבנית שטוחה לעזוב הטבעה על 4-6 שעות דלפק להתאדות PO. לחילופין, להסיר את המכסה של הצנצנת ולהשאיר על שייקר במשך 4 שעות (עובד היטב עם רקמה גדולה יותר). העברת דגימות שרף 100% במשך 4 שעות. שבץ שרף עובש הסופי עם תווית. לפלמר ידי דוגרים על 60 מעלות צלזיוס במשך 24-48 שעות. גזור לחסום בסכין גילוח הדרוש כדי למזער שרף זרים. חותכים סעיפים 1-2 סדרתי אממ על Ultramicrotome (E-Ultracut רייכרט יונג היה בשימוש). הר התמונה באמצעות מיקרוסקופיה epifluorescent. אופציונלי: כתמים חלק חלקים עם כתמים היסטולוגי (כלומר של Stevenel כחול) אם רוצים (מבין immunofluorescence לא יהיה ממושך בסעיפים אלה). פתרונות פתרונות אתנול: 100% אתנול מדולל במים מזוקקים עד 30%, 50%, 70% ו 95% בריכוז. פתרון קיבוע: 2.5 מערבבים Gluteraldehyde מ"ל 50%, 5 Paraformaldehyde מ"ל 10% ו 42.5 מ"ל 0.1M פוספט pH 7.4 חיץ (ריכוזים סופי: gluteraldehyde 2.5%, 4% PFA). חנות ב 4 ° C. שרף אפוקסי: הפוך על פי ההוראות המצורפות פולי / מיטה קיט 812 והטבעה Media/DMP-30 (Polysciences, Inc # 08792-1). חנות ב -20 ° C. 5. נציג תוצאות איור 2. מיקום לצבוע הדמיה lipophilic והן לעובר בעכבר. שלושה צבעים אורך גל שונה lipophilic הוזרקו וטופחו על מנת לאפשר הדמיה של העצב המשולש (TN), עצב glossopharyngeal (GN), ואת העצב התועה (VN) תחזיות המרכזית. א) מיקום לצבוע lipophilic לחלקים ההיקפיים של שלושת עצבי הגולגולת כדי לאפשר דיפוזיה אל גזע המוח להדמיה של תהליכים מרכזיים שלהם. TN התווית NeuroVue האדום, GN: בורדו NeurVue ו VN: Jade NeuroVue. ב) עכבר זהה לאחר דגירה (A). דיפוזיה חלקם ניתן לראות במיקרוסקופ brightfield. ג) עכבר זהה (A ו-B). למוח האחורי כבר גזור ועלה שטוח. תיוג חלק מן התהליכים המרכזיים של שלושת העצבים שכותרתו ניתן לראות במיקרוסקופ brightfield. D) תמונה של Confocal (C). עם השימוש של נוירונים ספציפיים confocal ניתן לראות, ושימוש של שלושה צבעים שונים מאפשרת הערכה של התפלגות אוכלוסיית כל ביחס לאחרים. צבעים הם צילמו ברצף. ג'ייד NeuroVue היה צילמו בשעה עירור של 488 ננומטר פליטת 500-550 ננומטר. NeuroVue האדום צילמו בשעה עירור של 535 ננומטר פליטת 550-600 ננומטר. בורדו NeuroVue היה צילמו בשעה עירור של 643 ננומטר פליטה ב 650-700 ננומטר. איור 3. סקירה סכמטי של הניסוי. האוזן חשוף כדי לאפשר הדמיה של מבנים כל. לצבוע lipophilic הואמוזרק אז מותר מפוזר. לאחר דיפוזיה באוכלוסיות עצביות שונות ניתן לראות שכותרתו על ידי צבעים שונים. לאחר מכן, הכלאה באתרו (Sox2) מבוצע על האוזן ותוויות ביטוי ה-mRNA. אימונוהיסטוכימיה מבוצעת לאחר מכן החוצה (Myo7, טובולין) לדמיין ביטוי חלבון. ואחריו סעיפים היסטולוגית שבה הן הכלאה אימונוהיסטוכימיה באתרו ניתן דמיינו.