Combinant colorant lipophile, In situ, immunohistochimie et l'histologie

1. Lipophiles injection de colorant Préparation des tissus: Tous les dissections des tissus et des manipulations sont réalisées sur des animaux fixés dans du paraformaldéhyde 4% (PFA) en tampon phosphate 0,1 M (pH 7,4) par perfusion transcardial utilisant des pompes péristaltiques avec des aiguilles de taille appropriée. Les tissus peuvent être stockés dans 4% PFA dans le réfrigérateur pendant jusqu'à 6 mois. Toutes les préparations et les manipulations sont effectuées dans 0,4% ou plus PFA jusqu'au montage avec le glycérol pour l'imagerie. Ce montant de PFA élimine efficacement RNases et préserve l'ARN pour l'hybridation in situ. Stockage Dye: Tous les colorants doivent être stockés dans un compartiment sombre et fermé pour minimiser la circulation d'air et l'exposition à lumière du jour, comme ils sont photosensibles. Pour éviter la contamination croisée, un ensemble distinct d'instruments devraient être utilisés pour traiter chaque colorant. Tout d'abord, un site d'application pour le colorant doit être choisie et tissus étrangers extraite afin de confirmer visuellement l'emplacement choisi, et l'accès pour le placement de la teinture. Choisir le site d'application est l'étape la plus importante dans ce processus. Choisir un bon site pour l'étiquette de la population neuronale en cours d'examen et non les structures extérieures peuvent être difficiles. La précision du placement dans un tube donné sous contrôle visuel dans le champ de dissection exige un certain niveau de compréhension de la neuroanatomie en question. Dye peut être soit placé au centre ou en périphérie d'étiqueter les projections périphérique ou central, respectivement, au besoin pour un projet donné (cerveau-dire, les nerfs périphériques, des oreilles, des yeux). Colorants Lipophic se diffuse dans tous les processus appartenant à un neurone donné, à la fois rétrograde et anterogradely, en remplissant un neurone donné ou tous les neurones projetant dans une piste donnée. NeuroVue colorant de MTTI est livré pré-chargé sur les bandes de filtrage pour une application facile. Dye peut également être dissous dans 100% de DMSO (travail sous le capot) et les cheveux minces peuvent être trempés dans cette solution et ensuite séchés pour les petites applications. La teinture du papier filtre préchargé est coupé en morceaux de taille appropriée triangulaire avec microciseaux. La taille de la teinture va dépendre de la taille de l'échantillon, la taille de la structure étant étiquetées, et nombre de couleurs utilisées simultanément. Veillez à couper le plus petit d'une pièce que possible pour éviter l'étiquetage d'autres structures. Après avoir utilisé microsissors pour la coupe et pince pour manipuler le colorant agiter les instruments dans l'alcool pour enlever tout résidu de teinture, puis sécher à l'air complètement, ou tamponner avec du papier. C'est pour éviter de contaminer l'échantillon avec de la teinture résiduels sur les instruments qui peuvent l'étiquette des structures indésirables. Pour l'insertion dans les tissus mous comme le cerveau, le filtre peut être inséré directement en utilisant un point du triangle de filtre pour percer le tissu. Pour plus de tissus rigides faire une incision pour permettre une insertion plus facile de colorant. Ne pas utiliser une aiguille à dissection pour pousser filtre en tissu. Cela peut causer de placement imprécis et perturbations du tissu. Insérer des longueurs d'onde suppléant de NeuroVue colorant comme nécessaire pour l'étiquetage des populations neuronales supplémentaires. Après avoir inséré le colorant, et en vérifiant sa position, des spécimens sont placés dans un flacon hermétiquement clos avec 4% PFA et incubées à 36 ° C dans l'obscurité pendant 2-14 jours en fonction de l'âge et la distance de diffusion pour être couverts (environ 2 mm par jours à 36 ° C). Un microscope à dissection avec epiflouresence peuvent être utilisés pour évaluer si le colorant a diffusé à l'endroit désiré, et l'échantillon peut être replacé dans la pépinière si la diffusion est jugée insuffisante. L'utilisation d'un champ normal, sans dissection epifluorescene pour détecter la diffusion sera sous-estimer la longueur réelle du colorant diffuse. Aussi, si la concentration de colorant est suffisamment élevée pour évaluer visuellement il peut causer l'absorption de trempe en utilisant la fluorescence émise. Le tissu désiré d'intérêt est disséqué et tout monté sur une lame avec le glycérol et lamelle pour l'imagerie avec un microscope confocal. Paramètres confocale sont décrites dans 1, 2. Si la taille des tissus inhibe toute fixation sur une lame, coupes sériées est nécessaire (voir ci-dessous). Plus de détails sur la préparation des tissus pour l'imagerie et de teinture des propriétés spectrales sont disponibles à: http://www.mtarget.com/mtti/documents/NeuroVuebrochuremar2010.pdf Figure 1. Vue schématique d'expérience. L'oreille est exposée pour permettre la visualisation de toutes les structures. Colorant lipophile est ensuite injecté et a permis de diffuser. Après la diffusion des populations distinctes de neurones peut être vu étiquetés par différents colorants. Ensuite, l'hybridation in situ (Sox2) est effectuée sur l'oreille et l'expression des ARNm des étiquettes. L'immunohistochimie est ensuite réalisée(Myo7, la tubuline) pour visualiser l'expression des protéines. Suivi par les coupes histologiques dans lequel les deux hybridation in situ et immunohistochimie peuvent être visualisées. 2. Hybridation in situ Dans le cas où vous voulez commencer par hybridation in situ (après quoi le traçage avec des colorants lipophiles sera impossible), se reporter à la préparation des tissus dans la partie 1. Chaque lavage, sauf si indiqué, est réalisée avec 2 ml de solution à température ambiante sur un onduleur / mixeur. Être sûr de travailler dans un endroit propre, RNase environnement libre. Déshydrater puis réhydrater les échantillons à travers une série de méthanol classés. 100% 1 heure pour la nuit à 4 ° C (en option: conserver les échantillons à -20 ° C dans du méthanol à 100%) 75% x 5 min. @ 4 ° C 50% x 5 min. @ 4 ° C 25% x 15 min. @ 4 ° C (ou jusqu'à ce que les puits de tissus) Transfert des échantillons à un tube Eppendorf de 2 ml (RNase). Laver trois fois dans du PBS (PBS 1x) et éteindre le four d'hybridation sur pour une utilisation future (60 ° C). PBS x 5 min. PBS x 5 min. PBS x 5 min. Tissus Digest avec 2 pi de 20mg / ml protéinase K stocks (Cat # Ambion AM2546) dans 2,0 ml de PBS frais. Réels temps de digestion PK dépend de l'âge de l'embryon. Ce qui suit est une estimation approximative du temps. Digestion doivent être étroitement surveillés que déprotéinisation est une étape critique. Sous-digestion se traduira par la pénétration de la sonde pauvres tout en sur-la digestion se traduira par une perte d'intégrité structurale. Un bon indicateur de la digestion est un changement dans le tissu de l'opaque à presque claire. Tableau 1. Temps de la digestion protéinase K sur le tissu de la souris. AGE (jour embryonnaire) Temps (minutes) E8.5 6 E9.5 10 E10.5 13 E11.5 15 E12.5 17 E14.5 18 E16.5 + 20 + Arrêtez la digestion par l'incubation des échantillons dans 4% des PFA pendant 5 min. Laver dans du PBS. PBS x 1 min. PBS x 5 min. PBS x 5 min. PBS x 5 min. Jeter PBS accordant une attention particulière afin d'éliminer autant que possible. Prehybridize échantillons: Incuber à 60 ° C sur l'onduleur dans 1,8 ml mélange d'hybridation pendant au moins 1 heure. Set bloc chauffant ISOTEMP à 85 ° C pour une utilisation future. Qu'une heure approche, dénaturer l'ADN de sperme de saumon (Invitrogen Cat n ​​° 15632-011) par incubation à 85 ° C pendant 10 min. Situé sur la glace jusqu'à utilisation. Après au moins 1 heure de préhybridation, ajouter 200 uL ADNss dénaturé et environ 100 ng de DIG-étiquetés ribosonde à chaque échantillon. Hybrider une nuit à 60 ° C dans un four à hybridation. Remplacer mélange d'hybridation avec 2 ml SSC 2X. Réglez les blocs de la chaleur ISOTEMP à 37 ° C et 70 ° C pour une utilisation future. Laver avec 2X SSC x 10 min. @ 60 ° C dans un four à hybridation. Laver avec 2X SSC x 10 min. @ 60 ° C dans un four à hybridation. Laver avec 2X SSC x 10 min. @ 60 ° C dans un four à hybridation. Laver avec du SSC 2X x 60 min. @ 70 ° C dans le bloc thermique ISOTEMP. 70 ° C supprime toute activité alcaline phosphatase endogène. C'est peut-être l'étape la plus importante vers la réduction de fond. La partie (d) peut être divisé en deux 30 minutes. lave afin de minimiser les dommages aux tissus. Laver avec du PBS x 5 min. Dégel RNase A enzyme sur la glace pour une utilisation future. Remplacer PBS et ajouter 1,0 ul de RNase A enzymatique (Fermentas EN0531 10mg / mL) x 60 min. @ 37 ° C dans le bloc thermique ISOTEMP (a 90 min. Période d'incubation est préférable si la sonde est très concentré). Jeter PBS / RNase A et laver 4 fois. Solution de lavage 1X x 10 min. Solution de lavage 1X x 10 min. Solution de lavage 1X x 10 min. Solution de lavage 1X x 60 min. @ 70 ° C dans le bloc thermique ISOTEMP. Incuber dans 1X tampon de blocage pendant 1 heure. A cette époque, préparer 2,0 ml de tampon de bloc et 1 ul (1:2000) anticorps anti-digoxigénine par échantillon. Inverser brièvement et laisser reposer à 4 ° C jusqu'à utilisation. Après une heure de tampon de bloc jeter et ajoutez 2,0 ml de tampon de bloc pré-absorbé + anticorps à des échantillons. Incuber une nuit. Jeter la solution bloc. Laver avec un tampon de lavage 1X. Tampon de lavage 1X x 5 min. Tampon de lavage 1X x 5 min. 1X tampon de lavage pendant 1 heure x 5-6 changements. Laver avec un tampon de lavage 1X nuit. Rincer à l'1X detectiobuffer n pendant 10 min. Transfert des échantillons dans le tampon de détection à l'assiette bien. Retirer du tampon et de détecter avec BM Violet (Roche 11442074001) jusqu'à ce que la force du signal désiré est obtenu (avec les sondes plus longues, cela peut signifier la nuit). BM violet est la lumière couvre sensibles avec du papier ou une boîte. Mix Violet BM avant l'utilisation. Assurez-vous que les échantillons sont flottement libre et non bloqué aux puits. Vérifier le signal après 1 heure. Rincer les échantillons avec le tampon de détection 1X en x puits 5 min. Image ou conserver les échantillons dans 4% des PFA à 4 ° C. * Les échantillons peuvent être imagées à ce stade et / ou après l'étape de l'immunohistochimie est ajouté (partie 3 ci-dessous). Solutions: Nucléase sans eau: Mélanger 1 ml DEPC (Sigma) avec 1L d'eau ultrapure stérile. Autoclave. PBS 1X: Mélangez 1 paquet de PBS (Sigma) dans 1L nucléase sans eau et stériliser par filtration. Solution de lavage 1X: Mélanger 450 ml d'eau nucléase gratuite + 50 ml de solution de lavage 10X et stériliser par filtration. Mélange d'hybridation: formamide à 50% en volume (25 ml), 50% en volume SSC 2X (25 ml), 6% de sulfate de dextrane en masse (3G). 1X tampon de détection: Mélangez 50 ml de tampon de détection 10X avec 450 ml d'eau nucléase libre et stériliser par filtration. Bloc tampon 1X: 5 ml de tampon 10X acide maléique (Roche tampon définie); 40 ml d'eau nucléase libres; 5 ml de tampon bloc 10X. 2X SSC: Mélanger 50 ml 20X SSC avec 450 ml d'eau nucléase libre et stériliser par filtration. Méthanol Graded: Diluer méthanol à 100% par la nucléase l'eau libre de 75%, 50%, et les concentrations de 25%. 3. L'immunohistochimie Les étapes 1 et 2 peuvent être omis si la partie 2 a été achevée. Dans ce cas, assurez-vous que tous glycérol ou tout autre support de montage est lavé. Notez que tous les anticorps seront toujours en mesure de détecter leur épitope après la protéinase K digestion. Nous avons une courte liste des anticorps qui peuvent être utilisés en combinaison avec l'hybridation in situ dans les tissus des mammifères car ils conservent leur spécificité (voir tableau 2). Bains successifs d'éthanol à débarrasser les tissus des colorants lipophiles (s'il n'est pas terminé à l'effet de la partie 2):.. 5min 50% d'éthanol, 70% d'éthanol 5 min, de l'éthanol à 95-100% pendant la nuit ou au besoin jusqu'à l'effet désiré, l'éthanol à 70% 5 min., 5min 50% d'éthanol. Réhydrater par incrémentale en ajoutant du PBS en 5-10 minutes. Bloc de tissu pendant 1 heure dans 2,5% sérum normal de chèvre (NGS) et 0,5% de Triton X-100 @ RT sur agitateur. (1:1 END 5%: 1,0% TritonX-100 dans du PBS 1X) Incuber avec l'anticorps primaire (s) dilué dans une solution de bloc 48-72 heures à 4 ° C sur agitateur. Laver avec du PBS pendant 1 heure x 3 changements. Bloquer comme à l'étape 3. Incuber avec l'anticorps secondaire (s) dilué dans une solution de bloquer pendant 12-24h à 4 ° C sur agitateur (Alexa Fluor ® colorants d'Invitrogen ont été utilisés). Laver comme à l'étape 5. (Option:.. Contre tache avec Hoechst colorant nucléaire tant que premier lavage diluée 10mg / ml dans le PBS stock de 1:2000 Suivez avec 1 hr lavages en PBS x 2-3 changements @ RT sur agitateur) Imagerie: Les échantillons peuvent être visualisés à cette étape à la fois avec la transmission et la microscopie à épifluorescence, préférentiellement en utilisant un système d'imagerie confocale pour la résolution ajouté. Pour ce faire nous avons l'habitude oreilles monter l'ensemble dans de la glycérine en utilisant des lamelles d'entretoises pour éviter de trop la compression des tissus. En plus ou au lieu de cette imagerie toute monture, les spécimens peuvent être inclus dans une résine époxy et des coupes sériées ajouté des détails histologiques. Pour bénéficier de l'ensemble combiné mount / section d'analyse, d'éviter le blanchiment du signal fluorescent lors de l'étape d'imagerie confocale. Solutions Solutions d'éthanol: Diluer 100% d'éthanol dans l'eau distillée à une concentration finale de 50% et 70%. Solution de bloc: 01:01 NGS dilution de 5%: 1,0% TritonX-100 dans du PBS 1X (concentrations finales de travail: NGS 2,5%, 0,5% TritonX-100). PBS 1X: Mélangez 1 paquet de PBS (Sigma) dans 1L d'eau distillée. 5% de NGS: Décongeler 2,5 ml NGS et mélanger avec 47,5 ml de PBS 1x. Conserver à 4 ° C. 1,0% TritonX-100: Mix 49,5 ml 1x PBS avec 0,5 mL TritonX-100 (laisser sur agitateur @ RT à mélanger pendant 1 heure). Conserver à 4 ° C. Solution de Hoechst stock de tache: Dissoudre 10mg colorant Hoechst par millilitre de PBS 1x. Tableau 2. Les anticorps qui travaillent avec la protéinase K tissu digéré. Cat # Item Vendeur 25-6790 Anti-myosine VIIA polyclonaux Proteus Biosciences 25-6791 Anti-myosine-VI polyclonaux Proteus Biosciences 9661 Clivée Caspase-3 polyclonaux Signalisation cellulaire T7451 Monoclon anti-tubuline acétyléeal Sigma PRB-238C Prox1 polyclonaux Covance 4. Histologie Histologie peut être introduit après la partie 1 pour augmenter la résolution du colorant lipophile traçage dans épaisses montures entiers tels que le cerveau juvénile ou après la fin des parties 2 ou 3. Pour des coupes de cerveau de série, nous recommandons l'Compresstome VF-700 microtome (Precisionary Instruments Inc, Greenville, Caroline du Nord) pour obtenir une épaisseur uniforme de la section. Des sections congelées sont moins optimales en raison de fuites de colorant plus grande pendant le processus de coupe 3. Préparation des coupes sériées et de montage dans la glycérine 4 est la méthode préférée de préparation des tissus où se monte tout ou montages en surface ne permet pas une bonne visualisation des régions tissu d'intérêt. Les tissus peuvent ensuite également être incorporé dans une résine époxy et de réduire à 1-2 um d'épaisseur à l'aide de couteaux de verre ou de diamant pour TEM. Lorsque vous utilisez cette technique la plus immunofluorescence restera et qui est encore plus stable après inclusion plastique, cependant, tous lipophiles traçage sera entièrement perdu à ce stade car ils se dissolvent dans une résine époxy et de l'alcool. Prenez des précautions que des échantillons seront sensibles à la lumière jusqu'à ce qu'ils soient embarqués. Pour Compresstome VF-700 de sectionnement microtome, suivez les recommandations de Precisionary Instruments Inc Époxy Embedding / sectionnement: Fixation: 2,5% glutaraldéhyde / 1% de la PFA en tampon phosphate 0,1 M (pH 7,4) 1h à une nuit. Dans un échantillon de tissu de verre déshydrater flacon: 30% d'éthanol (5 mn), 50% d'éthanol (5 mn), 70% d'éthanol (à 5 mn de la nuit), 95% d'éthanol (10min 5x chacun.), Et l'éthanol absolu (10min 5x . chacun). Transition solvants: 01:01 éthanol absolu: l'oxyde de propylène (PO) pendant 5 min. Solvants: PO 10min seulement 5x. chacun d'eux. Infiltration avec de la résine: 01:01 PO: la nuit de résine sur agitateur. Verser la solution d'échantillon (s) dans un moule plat et laissez intégration sur le comptoir 4-6 heures de s'évaporer PO. Sinon, retirez le bouchon du flacon et laisser sur vibreur pendant 4 heures (fonctionne bien avec plus de tissu). Transfert des échantillons à 100% de résine pendant 4 heures. Intégrer dans de la résine dans le moule finale avec l'étiquette. Polymériser par incubation à 60 ° C pendant 24-48 heures. Couper bloc avec une lame de rasoir au besoin de minimiser la résine étrangers. Couper 1-2 um coupes sériées sur un Ultramicrotome (E Ultracut Reichert-Jung a été utilisé). Mont et de l'image en utilisant la microscopie à épifluorescence. En option: Stain une partie des sections avec des taches histologiques (bleu-dire Stevenel a) si désiré (réalisation d'immunofluorescence ne sera pas soutenu dans ces sections). Solutions Solutions d'éthanol: Diluer 100% d'éthanol dans l'eau distillée à 30%, 50%, 70% et 95% des concentrations. Solution de fixation: Mélanger 2,5 mL glutaraldéhyde à 50%, 5 ml paraformaldéhyde 10%, et 42,5 ml 0,1 M tampon phosphate pH 7,4 (concentrations finales: glutaraldéhyde 2,5%, 4% PFA). Conserver à 4 ° C. Résine Epoxy: Faire conformément aux instructions fournies avec Poly / Lit 812 Embedding Media/DMP-30 Kit (Polysciences, Inc # 08792-1). Conserver à -20 ° C. 5. Les résultats représentatifs Figure 2. Lipophiles de placement de colorant et d'imagerie dans un embryon de souris. Trois colorants longueur d'onde différente lipophiles ont été injectés et incubé pour permettre la visualisation du nerf trijumeau (TN), nerf glossopharyngien (GN), et du nerf vague (VN) les projections centrales. A) Placement colorant lipophile dans les parties périphériques de trois nerfs crâniens pour permettre la diffusion au tronc cérébral pour la visualisation de leurs processus centraux. Le TN est étiqueté avec NeuroVue Rouge, GN: Maroon NeurVue, et VN: Jade NeuroVue. B) la même souris que dans (A) après incubation. Certains de diffusion peuvent être vus en microscopie fond clair. C) même souris que dans (A et B). Le cerveau postérieur a été disséquée et plat monté. Certains d'étiquetage des processus centraux des trois nerfs marqué peut être vus en microscopie fond clair. D) l'image confocale de (C). Avec l'utilisation des neurones spécifiques confocale peut être vu, et l'utilisation de trois colorants différents permet l'évaluation de la distribution de chaque population par rapport aux autres. Colorants ont été imagées séquentiellement. Jade NeuroVue a été imagée à une excitation de 488 nm et d'émission 500-550 nm. NeuroVue Rouge a été imagée à une excitation de 535 nm et une émission de 550 à 600 nm. Maroon NeuroVue a été imagée à une excitation de 643 nm et émission à 650-700 nm. Figure 3. Aperçu schématique de l'expérimentation. L'oreille est exposée pour permettre la visualisation de toutes les structures. Colorant lipophile estensuite injecté et a permis de diffuser. Après la diffusion des populations distinctes de neurones peut être vu étiquetés par différents colorants. Ensuite, l'hybridation in situ (Sox2) est effectuée sur l'oreille et l'expression des ARNm des étiquettes. L'immunohistochimie est ensuite réalisée (Myo7, la tubuline) pour visualiser l'expression des protéines. Suivi par les coupes histologiques dans lequel les deux hybridation in situ et immunohistochimie peuvent être visualisées.